核酸诊断是用分子生物学的理论和技术，通过直接探查核酸的存在状态或缺陷，从核酸结构、复制、转录或翻译水平分析核酸的功能，从而对人体状态与疾病做出诊断的方法。它的目标分子是DNA或RNA，反映核酸的结构和功能。检测的基因有内源性（即机体自身的基因）和外源性（如病毒、细菌等）两种，前者用于诊断基因有无病变，后者用于诊断有无病原体感染。

基因诊断的主要技术有核酸分子杂交、聚合酶链反应、恒温扩增、基因测序和生物芯片技术。

1.1 原理： 具有一定互补序列和核苷酸单链在液相或固相中按碱基互补配对原则缔合成异质双链的过程，称为核酸分子杂交。杂交的双方是待测核酸序列和探针序列。应用该技术可对特定DNA或RNA序列进行定性或定量检测。

1.2 基因探针及其标记： 基因探针是一段与待测DNA或RNA互补的核苷酸序列，可以是DNA或RNA，长度不一，可为完整基因，也可为其中一部分。根据探针的来源和性质分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针和人工合成的寡核苷酸探针。作为探针至少必须满足两个条件，一是应为单链（或通过变性形成单链），二是应带有可被示踪和检测的标记。有了合适的探针，就有可能检测出目的基因，观察有无突变，也可根据探针的结合量进行定量检测。选择探针最基本的原则是要有高度特异性，其次也需考虑到制备探针的难易性和检测手段的灵敏性等其他因素。

1.3 常用核酸分子杂交技术： ① Southern印迹杂交；② Northern印迹杂交；③斑点杂交（dot blotting）；④原位杂交（in-situ hybridization）；⑤夹心杂交（三明治杂交）；⑥液相杂交。

恒温扩增技术主要包括链置换扩增法( strand displacement amplification , SDA) 、核酸序列扩增法( nucleic acid sequence-based amplification ,NASBA) 、转录介导扩增法( Transcription Mediated Amplification , TMA) 和滚环扩增法(RollingCircle Amplification ,RCA) 以及环介导等温扩增法(Loop-mediated isothermal amplification , LAMP)等。

LAMP是Notomi 等在2000 年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法,即环介导等温扩增法( loop-mediated isot hermalamplification , LAMP) ,其特点是针对靶基因的6 个区域设计4 种特异引物,利用一种链置换DNA 聚合酶(Bst DNA polymerase) 在等温条件(65 ℃左右) 保温几十分钟,即可完成核酸扩增反应。不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程。LAMP 是一种崭新的DNA 扩增方法,具有简单、快速、特异性强的特点,具有替代PCR 方法的可能性。

（Re?sequencing），基于分子病理的医学基因测序在医疗机构中的实验室建设尚十分薄弱，其原因之一在于临床病理基因诊断的操作技术复杂、知识基础不足，可在很大程度上自动、准确地完成数万种不同类型的基因测序、突变检测。临床基因测序检测对病理科的形态诊断金标准含金量的提升和分子病理技术的开发及经济效益改善有现实意义。2年多来，我们完成了十多种病理基因测序及片段分析共1 100例的检测，体会如下：组织和血液DNA抽提成功率100%，石蜡标本首次抽提成功率80%，关键环节在于选用DNA抽提试剂盒，用中性甲醛固定时间＜48 h，充分洗脱甲醛且消化彻底；结果显示基线平整，各碱基平均信号强度（Ave Signal Intensity）在200~1 000之间，噪音（Noise）＜5，Raw基线接近0[1]。（基因测序结果如图1~3）；测序质量控制要点：模板DNA质量要高；PCR要求条带单一，但拷贝量要求不高；PCR产物一定要经过纯化处理，测序反应后推荐用酒精/NaAc法再纯化；电泳毛细管需定期养护和灌胶；通过检测肿瘤及相关基因的序列，总结出开展基因测序项目在病理外检中有如下几点临床应用意义：对于可疑癌前病变患者可以明确其病变标本是否真正含有候选基因的突变，以解除大量由免疫组化标记癌基因阳性患者的心理恐慌和经济负担[2]。对病理切片平面局部未能反映的淋巴结转移，通过全淋巴结组织DNA溶胶K?RAS癌基因测序，辅助检测临床微转移现象。鉴定心脑血管疾病APOE基因多态性6种基因表型，ε4高危类型与高脂血症、冠心病、脑血管病和老年性痴呆有关。对癌症家族有血缘关系的亲属检测相关癌基因突变或多态性，具有亚健康诊断和体检意义。对肿瘤分子靶向药物治疗检测C?kit[3]和EGFR 18、19、21外显子突变具有癌症治疗的积极意义[4~7]。YMDD突变检测乙肝病毒对拉米呋定的耐药性。

它们是DNA杂交探针技术与半导体工业技术相结合的结晶。该技术系指将大量探针分子固定于支持物上后与带荧光标记的DNA样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。

生物芯片技术起源于核酸分子杂交。所谓生物芯片一般指高密度固定在互相支持介质上的生物信息分子（如基因片段、CDNA片段或多肽、蛋白质）的微阵列杂交型芯片（micro-arrays），阵列中每个分子的序列及位置都是已知的，并且是预先设定好的序列点阵。微流控芯片（microfluidic chips）和液态生物芯片是比微阵列芯片后发展的生物芯片新技术，生物芯片技术是系统生物技术的基本内容。

什么是生物芯片呢？简单说，生物芯片就是在一块玻璃片、硅片、尼龙膜等材料上放上生物样品，然后由一种仪器收集信号，用计算机分析数据结果。

人们可能很容易把生物芯片与电子芯片联系起来，虽然，生物芯片和电子芯片确实有着千丝万缕的联系，但它们是完全不同的两种东西。生物芯片并不等同于电子芯片，只是借用概念，它的原名叫“核酸微阵列”，因为它上面的反应是在交叉的纵列中所发生。

芯片的概念取之于集成的概念，如电子芯片的意思就是把大的东西变成小的东西，集成在一起。生物芯片也是集成，不过是生物材料的集成。像实验室检测一样，在生物芯片上检查血糖、蛋白、酶活性等，是基于同样的生物反应原理。所以生物芯片就是一个载体平台。这个平台的材料则有很多种，如硅，玻璃，膜（纤维素膜）等，还有一些三维结构的多聚体，平台上则密密麻麻地摆满了各种生物材料。芯片只是一个载体。做什么东西、检测什么，还是靠生物学家来完成。也就是说，原来要在很大的实验室中需要很多个试管的反应，只在一块小小的芯片上即可完成，实现了高速、便捷的检测目标。

核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana 于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。

1983年的一天，美国科学家Kary Mulis驱车在蜿蜒的州际高速公路上行驶中，孕育出了PCR技术的原型。他在实验上证明了PCR的构想，并于1985年申请了有关PCR的第一个专利，在Science杂志上发表了第一篇PCR的学术论文。从此PCR技术得到了生命科学界的普遍认可，Kary Mulis也因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶 I的Klenow片段，其缺点是酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加。 1988年Saiki等人从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌中提取到一种耐热DNA聚合酶，克服了这个缺点，从而使PCR技术得到了广泛的应用，也使PCR成为遗传与分子分析的根本性基石。

经过十几年的发展，PCR成为实验室的常规技术。它是现代分子生物学研究中不可缺少的手段，是一种极为敏感的放大系统。相比于传统的临床诊断方法，核酸诊断是分子水平上的诊断技术，可以弥补传统临床诊断方法的某些缺陷，比如，核酸诊断能直接揭示病原体的存在，能客观反映病原体在人体内感染及活动情况，可以作为临床治疗中的一个有效监控手段，另外采用核酸诊断技术还可以检测到常规检测方法难以检测到的病原体，例如可以克服酶免检测技术中从感染到抗体产生的窗口期问题。因此，以PCR技术为代表的核酸诊断技术在临床诊断中得到日益广泛的应用。