埃莱奥诺雷出生在鲁汶，是奥地利大公腓力一世和卡斯蒂利亚女王胡安娜的长女与第一个孩子，当她只有一岁的时候已经被授予根特作为她的住所。她的童年和青年时代是在佛兰德斯度过的。她的弟弟妹妹包括未来的皇帝查理五世（1500年生）、斐迪南一世（1503年生）、伊莎贝拉（1501年生，后来成为丹麦国王克里斯蒂安二世的妻子）和玛丽（1505年生，后来成为匈牙利和波西米亚国王拉约什二世的妻子）。为了纪念她的曾祖母葡萄牙的莱昂诺尔，她被命名为埃莱奥诺雷。据说，腓力早逝后，导致他的妻子妄想症越来越多，埃莱奥诺雷和她的一些弟弟妹妹在梅赫伦一起被姑姑奥地利的玛格丽特爱护着长大。后者几乎像他们的母亲一样，聘请受过高等教育的尼德兰人和西班牙人作为他们的老师。埃莱奥诺雷的另外两个弟弟妹妹在西班牙长大，一个是1507年出生的卡塔琳娜，后来成为葡萄牙国王若昂三世的妻子，另一个是1503年出生的未来神圣罗马帝国皇帝斐迪南一世。

她年轻时，埃莱奥诺雷的亲人们曾试图把她嫁给未来的英国国王亨利八世，她也与亨利八世订婚。然而，当亨利的父亲去世，他成为国王亨利八世，亨利决定迎娶埃莱奥诺雷的姨母，阿拉贡的凯瑟琳，她是亨利八世的哥哥威尔士亲王亚瑟的遗孀。她的亲人们也试图把她嫁给法国国王路易十二、弗朗索瓦一世或波兰国王齐格蒙特一世，但这些计划都没有实现。1510年，埃莱奥诺雷也被提名为洛林公爵安托万·德·洛林的结婚候选人。

查理五世经常表示，埃莱奥诺雷是他最喜欢的姐妹。尽管如此，他也不允许她自由恋爱。因此，在1517年，她不得不在弟弟的压力下结束了与普法尔茨选帝侯弗里德里希二世的浪漫恋情。查理看了弗里德里希寄给她的情书，让她大吃一惊。查理对此非常不满。他们不得不在公证人面前起誓他们没有秘密缔结婚姻。随后弗里德里希就被迫离开了 佛兰德斯宫廷。

1517年夏末，埃莱奥诺雷陪同弟弟查理五世带着大批随从出海前往西班牙。1517年9月8日，他们乘坐由40艘船组成的船队从弗利辛根出发，但在暴风雨中陷入了困境，漂流到了荒凉的阿斯图里亚斯海岸。他们于9月底在比利亚维西奥萨登陆。因此，查理和他的同伴们被迫经过数周的山地行军，前往巴利亚多利德。1517年11月4日，查理和埃莱奥诺雷去看望他们的母亲胡安娜，他们几乎对母亲一无所知，自从腓力死后，胡安娜一直被关押在托尔德西利亚斯。

为了防止反叛的卡斯蒂利亚贵族可能得到葡萄牙人的帮助，查理五世让当时20岁的埃莱奥诺雷于1519年3月7日在里斯本嫁给了年长她将近30岁的老国王曼努埃尔一世。这是曼努埃尔一世第三段婚姻，他的前两任妻子分别是阿拉贡的伊莎贝尔和阿拉贡的玛丽亚，她们都是埃莱奥诺雷的姨母，而且曼努埃尔一世是埃莱奥诺雷的外祖母，卡斯蒂利亚女王伊莎贝尔一世的表弟，所以他是埃莱奥诺雷的表舅祖父，她的两位姨母也是和表舅结了婚。埃莱奥诺雷为丈夫生了两个孩子：卡洛斯（1520年2月18日-1521年4月15日）和玛丽亚（1521年6月18日-1577年10月10日，未来欧洲最富有的公主）。1521年，曼努埃尔一世去世，23岁的埃莱奥诺雷成为寡妇，埃莱奥诺雷最小的妹妹奥地利的卡塔琳娜嫁给了她的继子若昂三世，她带着女儿玛丽亚回到了她的弟弟查理五世的宫廷，查理五世已经成为神圣罗马帝国皇帝。

查理五世拒绝了普法尔茨选帝侯弗里德里希二世对埃莱奥诺雷的再次求爱，而是把他的姐姐作为反对法国国王弗朗索瓦一世的政治工具。法国的波旁公爵夏尔三世·德·波旁因没收亡妻的财产而与弗朗索瓦一世闹翻后，他准备站在皇帝一边。由于这次联盟的改变，波旁公爵打算迎娶埃莱奥诺雷，她于1523年7月18日与他订婚。然而阴谋被发现，波旁公爵不得不逃往意大利。

1524年底，弗朗索瓦一世前往意大利战场，但在帕维亚战役（1525年2月24日）中失败后，他沦为俘虏。他被带到了西班牙，在那里他没有受到友好的对待。最后，他同意他对手的许多要求，并在马德里的作出了和平承诺，此外他还将与埃莱奥诺雷结婚，他们举行了代理婚礼。

1526年2月16日，皇帝和法国国王从马德里骑马来到伊莱斯卡斯，第二天，以金发美女而闻名的埃莱奥诺雷见到了她未来的丈夫。她鞠躬并向他伸出手，但弗朗索瓦一世却殷勤地亲吻了她的手，据说他说他欠她的不是手的吻，而是嘴的吻。之后，两人在皇帝和阿拉贡国王费尔南多二世的遗孀热尔梅娜·德·富瓦的陪同下参加一场舞会。第二天，查理五世和弗朗索瓦一世再次拜访了埃莱奥诺雷。

1526年3月，法国国王获得自由，但要提供他的两个儿子作为人质。然而他随后宣布，他不会履行皇帝对他提出的要求，因为他是被迫签署《马德里条约》的。这也意味着他暂时不会娶埃莱奥诺雷。弗朗索瓦一世与教皇和意大利列强结盟；英格兰国王亨利八世也站在法国一边。意大利出现了新的战争冲突。法军在兰德里亚诺战役（1529年6月21日）中失利后，查理五世的姑姑奥地利的玛格丽特和弗朗索瓦一世的母亲萨伏依的路易丝谈判达成了《康布雷条约》(1529年8月5日)，即所谓的“夫人和约（Ladies' Peace）。该和约确认了《马德里条约》的基本内容，并且除其他外，再次规定了法王与埃莱奥诺雷的婚姻。

过了几个月，法国人才凑齐了赎回弗朗索瓦一世两个儿子的四吨黄金的赎金。1530年7月1日，在边境的比达索亚河畔，被囚禁四年的法国王子回到了祖国。埃莱奥诺雷和她的侍女们也乘船队渡过界河前往法国。埃莱奥诺雷和王子们随后前往见法国国王，而法国国王则从波尔多出发去见他未来的妻子和孩子，并在蒙德马桑附近与他们见面。埃莱奥诺雷和弗朗索瓦一世于1530年7月4日夜里两点在卡普蒂约修道院举行了婚礼。仪式由图尔农红衣主教主持。随后，这对夫妻和他们的随行人员驶向波尔多，埃莱奥诺雷在那里庄严地入场。财政大臣安托万·迪普拉和教廷高官们在此迎接这位身着紫色天鹅绒礼服、装饰华丽的法国新王后。1531年5月3日，她在圣德尼加冕，两天后进入巴黎。

虽然弗朗索瓦一世对妻子很尊重，但他与妻子相处的时间并不多，也很少履行婚姻义务。在回到法国后，弗朗索瓦一世的前一任官方首席情妇弗朗索瓦丝·德·富瓦就失宠了，现在他受到他的情妇安妮·德·皮瑟勒·德埃利的强烈影响，他把她提升为埃唐普公爵夫人。据亨利八世的一位代理人说，就在埃莱奥诺雷进入巴黎的当天，他就去了他的情妇那里，在一扇敞开的窗户上，在众目睽睽之下与她交谈了两个小时。埃莱奥诺雷在政治上仍然无足轻重，可能是因为她没有给国王生下孩子。尽管如此，她还是履行了一个尊贵王后的角色，有时会和丈夫一起出席在正式场合，比如1533年他的儿子亨利（亨利二世）与凯瑟琳·德·美第奇马德莱娜·德·瓦卢瓦和玛格丽特抚养长大。

埃莱奥诺雷竭力在丈夫和弟弟之间斡旋。然而，她出于政治动机的婚姻的首要目标，即解决哈布斯堡家族和瓦卢瓦家族之间的仇恨并没有实现。埃莱奥诺雷想促成弗朗索瓦一世第一次婚姻中的继子与哈布斯堡家族联姻的计划也没有成功。1536年，查理五世对弗朗索瓦一世的第三次战争爆发。最后1538年6月在尼斯，教皇保罗三世亲自斡旋，促成了皇帝与法国国王的十年休战。次年7月，两位君主在艾格莫尔特亲自会面，埃莱奥诺雷怀着和解与他们拥抱问候。诚然，本次会议也仍然没有达成具有约束力的协议。在对弗朗索瓦一世的第四次战争中，皇帝于1544年夏天出发前往巴黎，但很快就进行了谈判，埃莱奥诺雷也参与其中。她给弟弟写信说希望希望有一个持久的和平。1544年9月18日，《克雷比和约》结束战争。1544年10月22日至11月3日，埃莱奥诺雷随继子奥尔良公爵在布鲁塞尔逗留，看望了她的弟弟查理五世和妹妹玛丽。

弗朗索瓦一世于1547年3月31日去世，不久之后，埃莱奥诺雷离开法国到布鲁塞尔生活。1555年10月25日，查理五世在包括埃莱奥诺雷和妹妹玛丽在内的众多人面前宣告退位，并将尼德兰移交给他的儿子西班牙国王费利佩二世胡安娜的接待，她在哥哥费利佩二世不在的时候担任摄政。

1556/57年冬天，埃莱奥诺雷和玛丽在巴利亚多利德度过。从1557年夏末开始，他们住在埃斯特雷马杜拉的奥罗佩萨伯爵的城堡里，并从那里多次拜访查理五世，查理五世住在埃斯特雷马杜拉的尤斯特修道院。埃莱奥诺雷有一段时间一直想再见到她唯一的女儿玛丽亚，她在第一任丈夫去世与被迫在婚后不得不把她留在葡萄牙。但这方面的谈判却一拖再拖，因为葡萄牙方面以公主未婚为由拒绝让她前往西班牙。最后双方达成和解，在边境城市巴达霍斯安排了一次会面，1557年12月，埃莱奥诺雷和她的妹妹玛丽在仅有的几位大人物的陪同下前往那里。经过几个星期的等待，埃莱奥诺雷的女儿终于在1558年1月27日出现了，但她不顾母亲的爱，对母亲表现得相当傲慢与冷漠，两周后就离开了母亲。

在这次令人失望的会面之后，埃莱奥诺雷和她的妹妹玛丽于1558年2月10日踏上了前往瓜德罗普圣母院的朝圣之旅，但这位前法国王后在旅途的第一天就遭遇了晕厥。她被带到附近的塔拉韦拉德拉雷纳的一个农舍，8天后去世。她的弟弟妹妹查理五世和玛丽为她的死亡悲痛万分，并将于当年晚些时候也去世了。埃莱奥诺雷被安葬在圣洛伦索-德埃尔埃斯科里亚尔的埃斯科里亚尔修道院。