多顺反子见于
原核生物。意指一个
mRNA分子编码多个
多肽链。这些多肽链对应的
DNA片段则位于同一
转录单位内,共同拥有一个转录的起点和终点。
基本简介
顺反子的概念来自遗传学中的顺反重组试验,是确定交换片段究竟在一个基因内还是属于两个基因的试验,简言之,一个顺反子就是一个基因,多顺反子就是多个基因。
真核生物中也有多顺反子,比如C.elegans共有13500个基因,约25%的是多顺反子(polycistronicmRNA)。
分布范围
mRNA存在于
原核和
真核生物的细胞质及
真核细胞的某些
细胞器(如
线粒体和
叶绿体)中。
RNA病毒和RNA
噬菌体中的
RNA既是
遗传信息的载体又具有mRNA的功能。生物体mRNA种类的多少与
生物进化水平有关,高等生物所含的遗传信息多,mRNA的种类也多。生物体内某种mRNA的含量根据需要而有不同,如5龄蚕后部丝腺体的主要任务是快速合成大量
丝心蛋白,因而编码丝心蛋白的mRNA含量特别多。有些细菌需要不断适应外部环境,其体内编码某些
诱导酶的mRNA的含量也较多。
原核和
真核生物mRNA有不同的特点:①
原核生物mRNA常以多顺反子(见)的形式存在,即一条mRNA链编码几种功能相关联的蛋白质。真核生物mRNA一般以
单顺反子的形式存在,即一种mRNA只编码一种蛋白质。②原核生物mRNA的转录与翻译一般是
偶联的,即转录尚未完毕,蛋白质的转译合成就已开始。真核生物转录的mRNA前体则需经后加工,加工为成熟的mRNA与蛋白质结合生成
信息体后才开始,工作信息体中蛋白质与RNA之比约为3。③原核生物mRNA半寿期很短,一般为几分钟,最长只有数小时(RNA
噬菌体中的RNA除外)。真核生物mRNA的半寿期较长,如
胚胎中的mRNA可达数日。④原核与
真核生物mRNA的结构特点也不同。
一级
结构与功能的关系:
原核生物mRNA一般5'端有一段不翻译区,称前导顺序,3'端有一段不翻译区,中间是蛋白质的
编码区,一般编码几种蛋白质。如大肠杆菌
乳糖操纵子mRNA编码3条
多肽链;
色氨酸操纵子mRNA编码5条多
肽链。也有
单顺反子形式的细菌mRNA,如
大肠杆菌脂蛋白mRNA。原核生物
mRNA分子中一般没有修饰
核苷酸,也没有5'端
帽子结构和3'端聚腺苷酸尾巴。在原核生物mRNA的
起始密码子(AUG)附近(5'方向上游)的一小段长短不等的顺序,含有较多的
嘌呤核苷酸,被称为
SD顺序。它能和
核糖体小亚基上的16SrRNA的3'端富含
嘧啶核苷酸的区域配对结合,有助于带有
甲酰甲硫氨酸的
起始tRNA识别mRNA上的起始密码(AUG),使肽链合成从此开始。这段顺序是1974年由J.夏因和L.达尔
加诺发现的,所以称为SD顺序,也称核糖体结合部位。
原核生物mRNA的
编码区一般编码几种功能上相关联的蛋白质,两种蛋白质的编码区之间常有一小段不翻译的顺序,叫做
间隔区。有的噬菌体RNA中2个相邻的顺反子共用一段相同的编码顺序,例如,M噬菌体RNA中的溶菌蛋白编码区共225个核苷酸中有189个核苷酸是由相邻两个蛋白质共用的。原核mRNA与真核mRNA一样使用同一套三联体密码子(
真核生物线粒体mRNA有例外)。原核生物合成
氨基酸的
操纵子mRNA的5'端前导顺序上有一段顺序称作
弱化子。弱化子具有两种可以互变的构象,其中一种构象是
转录终止的信号,能使转录中止(或衰减)。衰减调节是
原核生物合成氨基酸的调控方式之一。
真核生物mRNA(细胞质中的)一般由5'端
帽子结构、5'端不翻译区、翻译区(
编码区)、3'端不翻译区和3'端聚腺苷酸尾巴构成。分子中除G构成帽子外,常含有其他修饰
核苷酸,如A等。5'端帽子结构通常有3种类型,即:G(5')ppp(5')N;G(5')ppp(5')N和G(5')ppp(5')N。[图1]
真核生物mRNA结构
示意图b5'端帽子结构式,表示
碱基,表示碱基是帽子的
化学结构,N右边的m代表
核糖2'位羟基的甲基化。
真核细胞线粒体中的mRNA无
帽子结构。一般认为帽子的功能与翻译的启动有关。许多真核生物mRNA(如
珠蛋白mRNA)除去帽子后翻译效率大大降低。5'端不翻译区,也叫前导顺序。不同的真核mRNA的前导顺序长度不同,有的只有10个核苷酸,有的则有200个核苷酸。与原核mRNA相似,真核mRNA5'端不翻译区中常有一段顺序与
核糖体小亚基上的18SrRNA的3'端的一段顺序互补并结合,这种结合与真核mRNA的翻译启动有关。
翻译区(
编码区)使用的
密码子除
线粒体(如人、牛和酵母线粒体)外与
原核生物mRNA是一样的。真核生物mRNA的
起始密码子都是AUG。真核和原核生物mRNA使用的密码子也都有“简并现象”,即几种不同的密码子翻译出同一种
氨基酸,但不同的mRNA中
简并密码子的
利用率是不同的,真核与原核生物之间的差别就更大。mRNA的
终止密码子有3个(
UAG、UGA和UAA),其功能是停止翻译,一般只用一个终止密码子就能使翻译停止。有的mRNA有2个连续的终止密码子(见)。3'端不翻译区的长短在不同的mRNA上有所不同,β珠蛋白mRNA只有39个核苷酸,而
卵白蛋白mRNA则有637个核苷酸。真核生物mRNA3'端不翻译区常有AAUAA(A)或AUUUA(A)等顺序,它们和识别多聚A
聚合酶及装配多聚A尾巴有关。除个别
组蛋白mRNA外,
真核生物mRNA3'端均有多聚A尾巴3'端多聚A尾巴的长度随来源不同而不同,且随mRNA的老化而变短,通常有20~200个A多聚A与
mRNA稳定性及mRNA从细胞核转到细胞浆中有关。
结构系统
此处描述的是一个新型的表达系统,用以从一个单一多顺反子构建体中产生目的多
基因产物。尤其是,该表达系统包含一个多顺反子载体,能够在
真核宿主细胞中表达功能抗体,其中载体在5′-3′方向上至少包含下面的可操作连接的元件:在
真核细胞可操作的
启动子;编码至少抗体轻链可变区的
DNA序列;
内部核糖体进入位点(
IRES);以及至少一个编码
抗体重链的DNA序列。也公开了包含多顺反子
表达载体的哺乳动物细胞,和一种在用多顺反子表达载体转染的
哺乳动物细胞中产生功能抗体的方法。
基因结构
来自德国
科隆大学遗传学系的JoëlSavard、DiethardTautz等人发现拟
谷盗(Tribolium,一种
昆虫)中的一个
分节基因(Segmentation
gene,负责昆虫身体分节的基因)能够产生一种可编码多种保守肽的
多顺反子mRNA。
昆虫的分节基因是早期
胚胎产生
体节必须的。在这篇论文中,德国的研究人员描述了拟谷盗的分节基因的gap家族的一个新成员mlpt。Mlpt基因的敲除会导致昆虫腹节变成
胸节,从而使胚胎产生多达10对足。研究人员证实在mlpt和已知的拟
谷盗gap基因之间发生着交互调节反应,在表明mlpt本身就是一个gap基因(裂缺基因)。Mlpt基因能反映出一种不同寻常的结构,因为它编码一种
多顺反子mRNA,而这种
mRNA又编码四种肽。
由于在其他昆虫基因组中也发现了具有多顺反子排列的
同源基因,因此研究人员推测Mlpt似乎是
真核细胞中这种先前未知的
基因结构的原型。
核仁
小分子RNA(snoRNA)是一类在
真核生物核糖体生物合成过程中起重要作用的
小分子RNA。通过计算机分析国际
分子生物学数据库及实验的方法,在
酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中发现和鉴定了一个新的snoRNA(Z8)及其特殊的基因组织.Z8snoRNA基因位于酿酒酵母第13号染色体上,是酵母snoRNA
基因簇的第1个基因,编码boxC/D类
反义snoRNA.
结构分析指出该snoRNA指导25SrRNA中第2421位尿苷酸的
核糖的甲基化。用
遗传学方法将该基因缺失后,其对应位点的甲基化被取消,但细胞的生长并未受到影响。Z8snoRNA基因的上游247位,有一UsnoRNA
启动子保守元素。
RTPCR的结果证明,Z8与该基因簇中其他snoRNA(Z7和Z6)基因共同转录成一个多顺反子的snoRNA前体,然后再被加工成熟,这是一种新的snoRNA
基因表达方式。
应用前景
⒈根据已发表的相关序列,分别设计引物,通过
PCR技术克隆了一系列构建水稻质体多顺反子
定点整合表达载体所需的元件:
质体核糖体(16S)RNA操纵元
启动子(Prrn)、质体psbA基因3′端
终止子(psbA3′)、
氨基糖苷3′-
腺苷酰基转移酶基因(aadA)、水稻质体
基因组高频
同源重组片段(psbC/trnG,大小3362bp),命名为crDNA、
甘露聚糖酶基因(man)、
绿荧光蛋白基因(
gfp)。构建了水稻质体多顺反子定点整合表达载体pLM21(-psbC-Prrn-RBS-man-RBS-gfp-RBS-aadA-psbA3′-trnG-)。将该载体用
基因枪轰击烟草叶片5枪,用添加了
壮观霉素的选择分化
培养基筛选。结果获得
质体转基因烟草4株。用PCR、激光扫描和Westernblot等方法检测都证实man、
gfp、aadA三个基因且均得到表达,用
RFLP证实表达盒整合到烟草质体
基因组中。
⒉利用
脑心肌炎病毒(EMCV)及
脊髓灰质炎(Polio)
病毒内核糖体
进入位点(IRES),连接mIL-12p40及p35
cDNAs和筛选基因
新霉素磷酸转移酶(NeoR),克隆至
逆转录病毒载体pGCEN中,使三个基因同时受逆转录病毒载体
5′端LTR启动子控制,转录至同一mRNA
转录本上,通过不同机制翻译成蛋白质,从而构建成多顺反子逆转录病毒载体,即pGCEN/mIL-12。在LipofectAMINE介导下将pGCEN/mIL-12转染
包装细胞PA317,G418筛选,直至出现
阳性克隆,挑取抗性克隆,扩大培养,收集上清,用
小鼠成纤维细胞NIH3T3测定
病毒滴度。然后用重组转录
病毒感染小鼠
肝癌细胞G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,对阳性克隆进行鉴定。结果是由PA317包装细胞产生的
重组逆转录病毒的
滴度为5×105CFU/ml,将其感染小鼠肝癌细胞,后经PCR及Southernblot证明,
外源基因已整合至小鼠肝癌细胞
基因组中,
RT-PCR及Northernblot分析外源基因在mRNA水平上的表达,并证实mIL-12p40及p35cDNA和NeoR基因转录在同一mRNA上。
ELISA显示mIL-12的表达量48h为10ng/106细胞。并且M45/mIL-12培养上清能刺激人
外周血单个核细胞增殖及诱导小鼠
脾细胞IFN-γ的产生(160U/ml)。
⒊一种新的基因治疗策略,即将不同
耐药谱基因导入正常
骨髓造血干细胞之获得耐药表型,加大
造血细胞与
肿瘤细胞克隆之间对
化疗耐受性的差别,增加骨髓对化疗的耐受性,以便能施行大剂量化疗、多次重复
给药使之最大限度清除
肿瘤细胞,发挥化疗效,为保护和及时恢复
造血功能提供了可行性。
本研究项目中
造血干细胞采用的是脐血干细胞[wangjishi,etal.LeukemiaReaearch.2002,26⑶281-288;实验生物学报2001,34⑶227-233]\u5916周血CD34+细胞[wangjishi,FangQinetaL.AxtaPharmacologicaSinica.2001,22⑽:949-955]和小鼠
骨髓细胞,转染
靶细胞显示对
化疗药物的抗性增加。有效表达,增加了细胞对亚硝基类药物(如BCNU)的耐受性,证实该基因具有明显的
细胞生物学效应。同进通过体外诱导突变技术获得了突变型MGMT,并成功构建到
逆转录病毒载体上。本研究为同内首次以RT-PCR方法从人肝组织克隆了06-
甲基鸟嘌呤-DNA-
甲基转移酶(MGMT)基因,与人类
基因文库MGMT基因同源性比为100%,将该
基因导入靶细胞后显示有效表达。
结构特点
m
RNA的含量最少,约占RNA总量的2%。mRNA一般都不稳定,代谢活跃,更新迅速,
半衰期短。
mRNA分子中从5′-未端到3′-未端每三个相邻的
核苷酸组成的三联体代表
氨基酸信息,称为
密码子。mRNA的生物学功能是传递
DNA的
遗传信息,指导
蛋白质的
生物合成。细胞内mRNA的种类很多,
分子大小不一,由几百至几千个核苷酸组成。真核生物mRNA的
一级结构有如下特点:
⒈mRNA的3′-未端有一段含30~200个
核苷酸残基组成的多
聚腺苷酸(polyA)。此段polyA不是直接从DNA转录而来,而是转录后逐个添加上去的。有人把polyA称为mRNA的“靴”。
原核生物一般无polyA的结构。此结构与mRNA由胞核转位
胞质及维持mRNA的
结构稳定有关,它的长度决定mRNA的半衰期。
⒉mRNA的5′-未端有一个7-甲基
鸟嘌呤核苷三磷酸(m7Gppp)的“帽”式结构。此结构在蛋白质的
生物合成过程中可促进
核蛋白体与mRNA的结合,加速
翻译起始速度,并增强mRNA的稳定性,防止mRNA从头水解。
在
细胞核内合成的mRNA初级产物被称为
不均一核RNA(
hnRNA),它们在核内迅速被加工、剪接成为成熟的mRNA并透出
核膜到
细胞质。