抗冻基因是最早由澳大利亚科学家从南极发草中发现的一种基因，这种基因使南极地带的草在-30℃的条件下仍可以存活，并从中识别出了一种特殊种类的基因蛋白，它能防止冰晶生长，避免冰晶给植物带来的伤害。近年来，随着基因工程的发展，对植物的抗冻性机理进行了深入的研究，并克隆了许多与抗冻性相关的基因。

澳大利亚科学家最近发现了一种“抗冻基因”，它能使花草等植物在南极半岛零下30摄氏度的低温环境中生存。研究人员认为，这一发现可以让人们在冬天也能种庄稼。

澳大利亚维多利亚州拉筹伯大学的吉尔曼·斯潘根伯格教授介绍说，这种基因是从一种名为南极发草的植物中发现的。他说，我们从中识别出了一种特殊种类的基因蛋白，它能防止冰晶生长，因此能避免冰晶给植物带来的伤害。

研究人员将这种“冰再结晶作用抑制基因”移植到了一株实验植物中，并且对抗冻基因进行了复制。斯潘根伯格教授表示，现在，我们弄清了它的作用机理，我们可以将这一知识运用到改善农作物、提高其抗寒抗冻性上去。”

该州发展部门的负责人长约翰·布朗比说，全球每年大约有5%至15%的农作物生产受到霜冻的影响。抗冻基因的发现可使因霜冻和寒冷天气条件造成的数百万美元的农作物损失得以避免。他说：“在接下来的几年中，基于对这些抗冻基因功能的分析，我们应该能够看到农作物抗冻技术的进一步发展和应用。”

无独有偶，科学家们发现长年生活在寒带的比目鱼不怕冻，因为比目鱼的身体里有一种抗冻蛋白质。科学家将比目鱼的抗冻蛋白质基因转移到西红柿里，培育出了抗冻西红柿，这种西红柿可以在冬季或较寒冷的地区种植，使得人们一年到头都能吃到西红柿。

抗冻蛋白质多为糖蛋白，它主要由两种氨基酸的重复单元构成，可以有效地控制大结晶的生成。 最早人们在南极和北极鱼中发现了抗冻蛋白质，这些鱼类生活在冰冷的水中而不被冻结，就是因为它们含有抗冻蛋白质，后来研究者又在越冬昆虫和黑麦类越冬植物中发现了抗冻蛋白质。掌握了抗冻蛋白质的作用机理，人们就能够用这种知识来对农作物进行改良，增强其抗冻性。

全球每年的农业收成都会因霜冻遭受大约5-15%的损失。在不久的将来，这项新发现将在农业生产中得到发展和应用，它可以为人类挽回数百万美元的经济损失。另外，抗冻蛋白质在食品工业中也有着广阔的应用前景，抗冻蛋白质的添加可有效防止冷冻贮藏中冰结晶的生成，如果在冰淇淋制品中添加微量的抗冻蛋白质，就可对冰晶体的生成形成有效抑制，从而令冰淇淋变得美味可口。

低温冻害是农业生产中严重的自然灾害，不仅会限制农作物的栽种范围，也会造成农作物减产，每年引起的农作物的损失巨大，所以有关植物抗寒性的研究，改造农作物的遗传特性，使之从冻害中解脱出来，一直都是植物学领域研究的热点之一，也是科学工作者的理想与追求。用传统的抗寒育种方法对提高植物抗寒性的作用很小，目前用传统育种方法得到的最耐寒的小麦品种抗寒能力与20世纪早期所研制的品种抗寒能力基本上一样。随着生物技术的发展和广泛应用，对抗寒分子机理的认识不断加深，人们开始采用基因工程培育抗寒新品种。

温度是影响植物分布、产量及品质的重要环境因素，提高植物抗冻性对农业生产具有重要的意义。近年来，随着基因工程的发展，对植物的抗冻性机理进行了深入的研究，并克隆了许多与抗冻性相关的基因。

植物生长发育过程中，温度作为一个重要的环境因子对其生长、生殖和分布起着关键的作用。低温不仅在很大程度上限制植物的种植范围，同时还会造成减产和品质下降，严重时甚至绝收。全球每年因低温伤害造成的农作物损失高达数千亿元，因此，植物抗寒性研究及抗寒育种一直是植物学研究领域的热点之一。

现代生物技术的迅猛发展为最终解决植物的抗冻性展现了良好的前景。利用现代分子生物学技术，人们已从植物中克隆出众多参与植株耐低温能力形成的基因，研究和分析这些基因的功能，对于揭示植物抗冻性的分子基础，加速植物抗冻性育种具有重要意义。

1 膜稳定性相关基因

生物膜是植物细胞及细胞器与周围环境间的一个界面结构，它能够接受和传递环境信息，对环境胁迫做出反应。同时，生物膜对保持植物正常生命活动也具有重要的作用。研究表明，生物膜是低温冷害作用的首要部位，而且低温伤害的原初反应发生在生物膜系统类脂分子的相变上。早在20世纪70年代，Lyons就提出“膜相变的寒害”假说，认为植物正常生理活动需要液晶相的膜状态，在遭受低温伤害时生物膜首先发生膜脂的物相变化，这时膜脂从液晶相变为凝胶相，膜脂上的脂肪酸链由无序排列变为有序排列，膜结合酶的活力降低，且膜上出现孔道或龟裂，使膜的通透性增大，膜内可溶性物质大量向膜外渗透，破坏了细胞内外的离子平衡。同时膜结合酶结构改变，酶促反应速度失去平衡，导致植物细胞生理代谢变化和功能紊乱，从而使植物细胞受到伤害。许多研究表明，膜脂中的类脂和脂肪酸成分的不饱和度明显影响膜脂的相变温度。一般认为，膜脂不饱和脂肪酸含量增高，膜脂相变温度会降低，增加了膜的流动性，从而使植物的抗寒性相应提高。反之，冷敏感植物的膜脂相变可能是由于膜脂脂肪酸的不饱和程度较低，低温下膜脂由液晶相向凝胶相转变，造成细胞膜膜相分离，从而引起细胞代谢紊乱。近年来，应用基因工程技术导入脂肪酸去饱和代谢关键酶基因，通过降低脂肪酸的饱和度以提高植物抗寒性的研究，已经取得了突破性的进展[8，9]。

日本国立基础生物化学研究所首先利用脂肪酸去饱和酶基因进行了植物抗寒性的分子改良。1993年，High等[10]筛选了一个膜脂不饱和脂肪酸突变蓝藻(SynechocystisPCC6803)菌株fad12，并克隆了Δ12去饱和酶基因desA，研究表明desA基因的表达是由于低温首先降低了膜脂的流动性，刺激desA的转录，使膜脂不饱和度增加，从而增加膜脂的流动性。Los等[11]发现，蓝细菌在低温胁迫过程中，desA基因的表达水平在1h内就增加10倍，抗寒性得到提高。Kodama等[12]将从拟南芥中克隆的叶绿体ω23脂肪酸去饱和酶基因(FAD7)导入烟草中进行表达，转基因烟草中十六碳三烯酸和十八碳三烯酸含量提高，其前体物质相应减少，在l℃低温下表现出明显的抗寒性。Ariizumi等将FAD7基因导入水稻中，获得的转基因植株不仅增强了抗寒性，而且也提高了低温下的光合速率和生长速率。除了FAD7基因外，Gibson等从拟南芥中分离得到另一个受低温诱导的脂肪酸去饱和酶基因FAD8，编码合成叶绿体ω23去饱和酶，它与FAD7基因具有75%的核苷酸同源组成，两者的叶绿体ω23去饱和酶能够彼此功能互补，共同催化膜脂中脂肪酸的去饱和。此外，John等又从蓝细菌和高等植物中克隆了分别编码Δ6、Δ9以及ω23酰基酯去饱和酶的基因desD、desC和desB，这些基因均具有冷调节特性。Ovkova等将从蓝细菌中克隆的Δ9去饱和酶基因des9转入烟草后，转基因烟草叶片中不饱和脂肪酸的含量和植株低温耐受性均有很大的提高。Kwon等克隆了辣椒(Capsicum)叶绿体ω23脂肪酸去饱和酶基因，而且在辣椒基因组中存在一个小的基因家族，该基因在叶片中表达而在根中不表达，当叶片受到伤害时转录量迅速提高，并且随后亚麻酸的含量提高。

脂酰甘油(PG)具有较多的饱和脂肪酸，是决定膜脂相变的主要因素。而甘油232磷酸酰基转移酶(GPAT)又是PG生物合成过程中的第一个酰基酯化酶，对决定植物膜PG的不饱和度起关键作用。目前已获得多种植物GPAT基因的cDNA或基因组DNA片段。1992年Murata等将冷敏植物南瓜的GPAT酶基因转至烟草，植株膜脂脂肪酸饱和度增加，相反转移抗冷植物拟南芥的酰基转移酶基因，能够使烟草内囊体PG的脂肪酸组成趋向不饱和，烟草植株抗寒性大大提高。Wolter等将GPAT基因导入烟草和拟南芥，结果改变了其体内磷脂酰基甘油的脂肪酸组成，提高了其不饱和度，增强了抗寒性。Ariizumi等将拟南芥和菠菜的AGPAT和SGPAT基因分别转化水稻，T1代植株叶片内磷脂酰甘油的顺式不饱和脂肪酸含量均明显高于野生型；同时转基因植株的鲜重也明显高于对照。Yokio等将拟南芥的GPAT基因导入水稻中，结果提高了叶片叶绿体膜上PG的不饱和脂肪酸含量，从而增强了水稻的抗寒性。由以上论述可见，利用生物技术的方法改变植物体内脂肪酸代谢途径，增加不饱和脂肪酸含量，可提高植物的抗寒性。

2 抗氧化酶活性基因

大量研究表明，植物在低温胁迫过程中，对O2的利用能力降低，多余的O2则在代谢过程中被转化成对植物有毒害作用的活性氧(ROS)，打破体内活性氧平衡，从而引发或加剧膜脂过氧化作用，降低膜脂的不饱和度，并可引起膜蛋白的聚合及变性，导致膜脂流动性降低，膜通透性增强，生物膜受损。一定范围的低温胁迫下，植物可以动员其自身抗氧化防御系统清除自由基，调节膜透性及增加膜的结构和功能稳定性，减少细胞伤害。但是这种自身保护具有一定的限度，超出某一范围即会成为不可逆的伤害，最终致使整株死亡。植物抗氧化防御系统由包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和谷胱甘肽还原酶(GR)等组成。低温胁迫下这些物质协同作用以去除植物体内的活性氧自由基，其中尤以SOD最为重要，它是植物体内第一个清除活性氧的关键抗氧化酶。

近年来，利用基因工程技术通过转入抗氧化酶基因来提高植物抗寒性已成为研究的热点。McKersie等将烟草中克隆的Mn2SOD的cDNA置于35S启动子下转化到苜蓿的线粒体和叶绿体等细胞器中，提高和增强了转基因植株中超氧化物歧化酶的含量和活性，并经大田试验发现大大提高了转基因植株越冬存活率，同时还增强了对除草剂二苯乙醚的抗性，除草剂对植株的生长抑制明显减轻。低温造成烟草株高、叶片数和生物量显著下降。Gupta等将豌豆的Cu/Zn2SOD基因导入烟草中，发现转基因植株的叶绿体中SOD基因超量表达，同时也提高了APX的活性，从而增加了烟草抵抗低温引起光抑制的能力，提高了转基因植株对冻害的耐受力。Allen等将SOD基因转入烟草中，增强了烟草的抗氧化能力;将其转入棉花，也增强了转基因棉花植株对低温逆境的抗性。Samis等将Mn2SOD基因导入紫花苜蓿，不仅提高了转基因植物的膜稳定性，同时还增加了植物的生物量。此外，APX和谷氨酰胺合成酶与植物的抗寒性也有关系。Sato等报道，热激处理水稻幼苗后可诱导APXa基因的表达，使APX活性升高，从而提高水稻幼苗的抗寒性。Liorente等从水稻基因组中克隆了与POD活性有关的冷诱导基因RCI3，该基因不仅对低温有很高的耐受性，而且对水分和盐胁迫也有很好的耐受性。说明利用基因工程手段将抗氧化酶基因转入植物中，清除植物在低温胁迫过程中产生的对植物有毒害作用的活性氧物质，能够提高植物的抗寒性。

3 抗冻蛋白基因

抗冻蛋白(antifreezeprotein，AFP)是一类具有热滞效应和冰晶生长抑制效应的蛋白质，能以非线性形式降低水溶液的冰点，但对熔点影响甚微，从而导致水溶液的熔点和冰点之间出现差值，它们在受低温环境胁迫时能使有机体抵御冰冻环境。抗冻蛋白最早是在极地海鱼中发现的，在鱼类和昆虫类中研究比较深入，目前已有将这类基因转入植物的报道。黄永芬等采用花粉管通道法及子房注射法将美洲拟鲽afp基因导入番茄，田间抗寒性实验表明，在春季平均气温低于正常年份4。4℃的条件下，转基因植株生长优于对照，致死温度也比对照降低了2℃。对植物AFP的研究较晚，1992年，加拿大Griffith等首次报道从经过低温锻炼可忍受细胞外结冰的冬黑麦中发现了植物内源性AFP，标志着植物抗冻蛋白研究的开始，随后已从多种植物中获得具有热滞效应的AFP。1997年Wallis等将植物凝集素基因和AFP基因共同构建到植物转化载体pKY2LX35S中，之后在转化马铃薯中发现，在-2℃条件下，非转基因马铃薯叶片的电渗值比转基因马铃薯叶片的高2倍多，而且非转基因植株遭受到了严重的冻害。Worrall等从冷诱导的胡萝卜中纯化出一种分子量为36kD的AFP，并克隆了它的基因，之后将AFP基因导入烟草，所获得的转基因烟草提取物能抑制冰晶生长，而且转基因植株的抗冻性明显高于对照。1999年，Meyer等[38]采用CaMV35S启动子，用农杆菌介导胡萝卜AFP基因重组子转化拟南芥，转基因植物提取液有明显的抗冻活性，能够修饰冰晶形态，表明抗冻活性与AFP基因转录水平呈正相关。2001年，尹明安等克隆了胡萝卜AFP基因，并构建了其植物表达载体，为进一步利用其转化番茄、甜椒等作物奠定了实验基础。Huang等将树状抗冻基因DAFP21转入拟南芥，转基因植株的抗冻性和对照植株相比提高了0。6~3。3℃。王艳等将准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白基因MPAFP149转入烟草中，-1℃处理48h，发现转基因烟草的相对电导率和表型明显优于野生型烟草。室温恢复试验验证表明，转基因烟草可存活并恢复生长，而野生型烟草受到了不可逆的低温冻害。

抗冻蛋白的发现为植物抗寒性研究提供了一条新的途径，这类蛋白质具有高度的亲水性和热稳定性，能够保护植物细胞免受低温伤害。但是目前从植物中分离克隆并能够用于转化的植物抗冻蛋白基因并不多，因此今后关于植物抗冻蛋白基因的分离克隆将是植物抗寒基因工程研究的一个热点。

4 低温信号转录因子

植物在遭受低温胁迫时，从感受低温信号到发生一系列生理生化反应和调节基因表达，进而产生抗寒能力，存在一个复杂的信号网络传导系统，CBF(CRT/DRE2bindingfactor)转录因子调控的信号传导途径是其中的一个传导系统，其传导途径为：CBF转录因子→CRT/DRE基序→COR基因表达→植物抗寒性增加，即转录活性因子CBF结合到CRT/DRE基序上，诱导了COR基因表达，从而提高了植物的抗寒性。

1997年，Stocking等首次从拟南芥中分离鉴定出一种编码转录因子的cDNA，这种转录因子能识别COR基因中的CRT/DRE元件并与之结合，故命名为CBF1(CRT/DREbindingfactor1)，即CRT/DRE结合因子。将CBF1蛋白基因转入未经冷驯化的拟南芥中，大量表达后能诱导冷诱导基因在常温下表达，增强了拟南芥的抗寒能力。后来人们发现拟南芥CBF1基因属于一个包括CBF1、CBF2、CBF3、CBF4、CBF5和CBF6基因在内的CBF基因家族，该基因家族成员均具有提高植物抗寒性的功能。甄伟等将CBF1基因转入烟草和油菜基因组中，对转化的烟草和油菜抗寒性的检测结果显示，转基因油菜的抗寒性有明显提高，转基因烟草的抗寒性也有一定提高。Hsieh等将拟南芥的CBF1转入番茄，转基因番茄叶片中的过氧化氢酶的活性比对照显著提高，H2O2含量比对照明显降低，转基因植株的抗寒性得到显著改善。韦善君等将玉米泛素启动子(Pubi)调控的CBF1基因转化烟草，发现CBF1组成型表达增强了转基因烟草的抗寒性。金建凤等将CBF1基因转入水稻中，发现低温处理后转基因植株体内脯氨酸含量比野生型明显增加，植株的抗寒性也明显增强。金万梅等利用根癌农杆菌介导的方法将拟南芥CBF1基因导入草莓中，提高了草莓对低温胁迫的抵抗力。拟南芥CBF3基因的过量表达也能够提高植株耐低温胁迫的能力，并且导致许多与低温胁迫有关的生理生化变化，影响脯氨酸和糖的代谢。Song等成功地将外源CBF3基因转入水稻，提高了转基因植株对逆境胁迫的抗性。Haake等CBF4基因转入拟南芥中，并利用35S组成型启动子使其过量表达，结果使CBF4转基因拟南芥的抗寒性和抗旱性都大大提高。植物抗寒性是由多基因控制的性状，往往需要一系列相关基因的共同表达才能提高植物的抗寒性。目前虽然还不知道利用基因工程手段将低温信号转录因子基因转入植物中诱导了哪些基因的表达，但是在植物抗寒育种中转入该类基因比转入单个抗寒基因的应用前景更为广阔。

5 渗透调节基因

在渗透胁迫过程中，植物体内会产生一些具有保水作用的渗透调节物质来降低植物体内的水势，从而维持体内的水分平衡。这类渗透调节物质有脯氨酸、甜菜碱、可溶性糖和醇类物质等。低温胁迫时，植物通过诱导渗透调节物质的生物合成酶基因的大量表达，以增加这类物质的积累，维持渗透压的平衡，从而避免低温伤害。

脯氨酸是水溶性很大的氨基酸，具有较强的水合能力。在植物受到低温胁迫时，脯氨酸的增加有助于细胞的持水，防止水分散失，起到渗透调节作用。Nanijo将脯氨酸脱氢酶(脯氨酸降解关键酶)反义基因AtproDH的cDNA转入拟南芥，很好地抑制了脯氨酸脱氢酶的产量，提高了胞内脯氨酸水平，增强了植物对低温和高盐的耐受性。甜菜碱是另一类常见的渗透调节物质，其化学性质与脯氨酸相似，它一方面通过与蛋白质的相互作用保护生物大分子在高电解质浓度下不变性，另一方面又可以作为渗透平衡物维持细胞的膨压。Pilon2Smits等将从细菌(Arrhobacterpasceus)中克隆的胆碱氧化酶COX基因(甜菜碱合成途径中的重要代谢酶)转入拟南芥、烟草和油菜中，获得了高甜菜碱水平的转基因植株。同时，Pilon2Smits等还发现转化植株甜菜碱的积累有助于种子吸胀萌发及幼苗早期生长对低温的忍耐。Su等将从细菌中克隆到的COX基因转入到水稻后，发现提高了转基因水稻叶片中甜菜碱的浓度，转基因植株对盐和低温有较强的忍耐性。Kumar等将甜菜碱醛脱氢酶BADH基因(甜菜碱合成途径中的另一重要代谢酶)转入胡萝卜后，发现转基因植株对低温和盐胁迫的能力明显增强。果聚糖是一种多聚果糖分子，因其良好的水溶性而具有调节渗透压的功能。Huang等将杆菌(Bacillussubtilis)编码果聚糖的基因SacB转入烟草，结果转基因烟草表现出比对照更强的抗渗透胁迫能力;王关林等将从枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)中分离克隆的果聚糖合酶基因SacB导入番茄中，抗冻实验结果证明，转果聚糖合酶基因的番茄具有良好的抗寒性。随着分子生物学的发展，许多与渗透调节物质代谢有关的基因被克隆，将这些基因导入植物中，增加这类渗透调节物质在转基因植物中的含量，以提高其抗寒性，这在植物抗寒育种中显示了较大的应用潜力。

随着对植物抗寒分子机理的深入研究，分子生物学及生物化学技术的不断发展，为低温相关基因的克隆及其应用研究奠定了坚实的基础，利用基因工程使植物获得抗寒性成为植物抗寒育种最有效的途径之一。但由于植物抗寒基因工程是一个新兴研究领域，研究基础比较薄弱，还有许多问题有待进一步研究：

(1)抗寒基因工程大多是围绕单个基因研究，但植物的抗寒性是由多基因控制的性状，仅靠转移1个基因就获得抗寒的植物比较困难，转化单基因植株抗寒性提高的程度相当有限，因此必须转移多个基因，但目前同时转化多个基因的技术还不成熟。(2)可利用的目的基因不多。植物的抗寒性受一个庞大的调控网络控制，涉及大量的基因，而目前分离的主要是一些保护类的基因，且多来自拟南芥等模式植物。要想植物的抗寒育种取得更大的突破，必须从不同的植物分离更多的基因，深入研究植物的抗寒分子机理。

(3)转基因的表达系统不完善。目前，抗寒基因工程多采用CaMV的35S组成型强启动子来启动外源基因在植物体内的组成型表达，虽在逆境下能较好地提高植物抗寒水平，但在非逆境下，这种不必要的高表达也给植物带来许多负面效应。首先，外源基因过强表达会消耗大量的能量，将会导致转基因植物在正常环境下都会出现生长被严重延滞的现象；其次，在无寒冻胁迫的时候，外源基因表达也是不需要的，因此这类启动子不能作为植物抗寒基因工程中最适启动子长期使用。解决这一问题的关键在于寻找植物内源特异性启动子，从而使抗性基因在低温胁迫时能诱导大量表达的同时，又不影响转基因植物的正常生长发育。相信随着分子生物学技术和方法的不断发展，用基因工程方法提高农作物的抗寒性必将取得可喜的进展，并将具有广泛的实际应用前景。