绿色荧光蛋白
荧光标记物
绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,简称GFP),是一个由约238个氨基酸组成的蛋白质,从蓝光到紫外线都能使其激发,发出绿色荧光。虽然许多其他海洋生物也有类似的绿色荧光蛋白,但传统上,绿色荧光蛋白(GFP)指首先从维多利亚多管发光水母中分离的蛋白质。这种蛋白质最早是由下村修等人在1962年在维多利亚多管发光水母中发现。这个发光的过程中还需要冷光蛋白质水母素的帮助,且这个冷光蛋白质与钙离子可产生交互作用。
名词简介
绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,简称GFP),是一个由约238个氨基酸组成的蛋白质,从蓝光到紫外线都能使其激发,发出绿色荧光。虽然许多其他海洋生物也有类似的绿色荧光蛋白,但传统上,绿色荧光蛋白(GFP)指首先从维多利亚多管发光水母中分离的蛋白质。这种蛋白质最早是由下村脩等人在1962年在维多利亚多管发光水母中发现。这个发光的过程中还需要冷光蛋白质水母素的帮助,且这个冷光蛋白质与钙离子可产生交互作用。
在维多利亚多管发光水母中发现的野生型绿色荧光蛋白,395nm和475nm分别是最大和次大的激发波长,它的发射波长的峰点是在509nm,在可见光谱中处于绿光偏蓝的位置。绿色荧光蛋白的荧光量子产率(QY)为0.79。而从海肾(sea pansy)所得的绿色荧光蛋白,仅在498nm有一个较高的激发峰点。
细胞生物学分子生物学中,绿色荧光蛋白(GFP)基因常用做报告基因(reporter gene)。绿色荧光蛋白基因也可以克隆脊椎动物(例如:兔子)上进行表现,并拿来映证某种假设的实验方法。通过基因工程技术,绿色荧光蛋白(GFP)基因能转进不同物种的基因组,在后代中持续表达。现在,绿色荧光蛋白(GFP)基因已被导入并表达在许多物种,包括细菌酵母和其他真菌,鱼(例如斑马鱼),植物,苍蝇,甚至人等哺乳动物的细胞。
发展历史
1962年,已经有文献报道科学家从多管水母属的发光型水螅水母(luminous hydromedusan Aequorea)中提取到了具有生物发光性质的蛋白质。到了上世纪70年代,对生物发光的现象才有了一些新的进展。有科学家研究了多管水母属生物发光系统的分子内能量转移。到了九十年代初,科学家才克隆到GFP的cDNA,并且研究了其表达的氨基酸序列,发现 gfp 10 cDNA 编码238个氨基酸肽段。研究A. victoria GFP 基因克隆,发现GFP基因上面有三个限制性酶切位点。这对后续科学家了解其结构有很大的帮助。
1994年2月,M. Chalfie 等人创造性的将GFP分别在Escherichia coli和Caenorhabditis elegans细胞中表达,并得出结论由于GFP发光并不需要其他底物或者共同作用因子,所以GFP的表达可以用来在活体中监测基因表达和蛋白质的定位。从那以后的一段时间内,有无数的研究者投入到GFP相关的研究。就在 M. Chalfie 的报道过去一个月左右,Tsuji 等人就在E. coli中融合表达了GFP 蛋白,并且 GFP 在生物体中的激发光谱和发射光谱与自然条件下没有明显区别。由于 GFP 在生物体中的荧光强度不够强,因此很难应用到实际的科学研究中。1995年,Tsien 等人提升了 GFP 发光强度,极大的推动了 GFP 在生物学研究的应用。紧接着在1996年8月 F. Yang 等人就解析出了GFP的分子结构,GFP蛋白是圆桶状,由11个β-折叠形成外周,里面有一个α-螺旋,圆桶的两端是一些不规则卷曲。同年9月,Tsien 等人就解析出了GFP的晶体结构,并阐明其发光原理。还有一些科学家通过制造突变体来筛选更优的GFP,比如:对pH敏感的GFP、专门应用于植物细胞研究的GFP,等等。除了优化GFP之外,很多科学家开拓思维,将GFP蛋白的应用推广到很多研究领域,2002年,David A. Zacharias 等人就将GFP蛋白应用到膜蛋白的研究。同年,GFP蛋白甚至被做成了Zn生物探测器。
结构
野生型绿色荧光蛋白,最开始是 238 个氨基酸的肽链,约 25KDa。然后按一定规则,11 条β-折叠在外周围成圆柱状的栅栏;圆柱中,α-螺旋发色团固定在几乎正中心处。发色图被围在中心,能避免偶极化的水分子、顺磁化的氧分子或者顺反异构作用与发色团,致使荧光猝灭。
荧光是荧光蛋白最特别的特点,而其中的发色团起着主要的作用。在 α-螺旋上的 65、66、67位氨基酸——丝氨酸酪氨酸甘氨酸经过环化、脱氢等作用后形成发色团。有意思的是,发色团形成过程是由外周栅栏上的残基催化,底物只需要氧气。这暗示绿色荧光蛋白被广泛用于不同物种的潜力:在不同物种中能独立表达成有功能的蛋白,而不需要额外的因子。不过,现在依然在讨论准确的过程。
发色团上的共轭 π键能吸收激发光能量,在很短的时间后,以波长更长的发射光释放能量,形成荧光。
应用
由于荧光蛋白能稳定在后代遗传,并且能根据启动子特异性地表达,在需要定量或其他实验中慢慢取代了传统的化学染料。更多地,荧光蛋白被改造成了不同的新工具,既提供了解决问题的新思路,也可能带来更多有价值的新问题。
荧光显微镜
主条目:荧光显微镜
GFP和它的衍生物的可用性已经彻底重新定义荧光显微镜,以及它被用来在细胞生物学和其他生物学科的方式。其中,最令人兴奋的就是用于超分辨显微镜成像。
参见
最新修订时间:2024-01-28 20:20
目录
概述
名词简介
参考资料