叶绿体是植物进行光合作用和能量转化的重要细胞器。叶绿体基因组的特点是具相同或相关功能的基因组成复合操纵子结构。叶绿体遗传体系，是构成植物细胞中三个遗传体系之一。叶绿体DNA编码一系列重要性状，例如，在光合作用中固定CO2的RuBPC酶的大亚基，并且与某些高等植物的花粉育性有关，是染色体外遗传研究的主要对象。

叶绿体遗传工程最适合表达高水平的疫苗抗原，生产治疗性蛋白质。已经有几种治疗性蛋白质通过转基因烟草的叶绿体表达，包括霍乱、炭疽热、鼠疫和破伤风疫苗抗原，单克隆抗体，和其他的用在人身上的治疗性蛋白质：人生长激素、人血清白蛋白、干扰素、类胰岛素生长因子和抗菌蛋白等。然而，急需的还是利用基因工程方法生产口服的治疗性蛋白质和疫苗抗原。口服制剂可以大大降低生产、纯化、冷藏和运输成本，并且能够避免静脉注射引起的并发症。

胡萝卜是表达治疗性蛋白质的最佳选择，因为整合转基因质体的基因组通过母系遗传，并且对于这个两年生植物来说，在生长的第一年不开花即可收获块状根。这两个特征使胡萝卜作为制药作物不会对食用作物造成任何污染，符合各级管理机构的要求。胡萝卜体细胞胚胎来自于单个细胞，通过多级胚胎发生增殖而成，并且可以在体外培养保持数年；从而可以提供统一的细胞源，这对生产治疗性蛋白质是必须的（来源统一）。胡萝卜细胞分裂速度快，用生物反应器能够产生大量细胞。携带治疗性蛋白质的胡萝卜细胞不需要进行任何烹饪，这样在服用时可以更好的保护治疗性蛋白质的完整性。利用人造种子技术，体细胞胚胎可以冷藏保存数年的时间。因此，携带药性和增强营养水平的转基因胡萝卜有至关重要的药用价值，能够大大提高人类的健康水平。然而必须说明的是，含有治疗性蛋白质的新鲜蔬菜绝对不能直接口服，必须把细胞冻干，包装成胶囊，按计量服用。

转基因可以在胡萝卜培养细胞的原质体中大量表达，与以前的报道相比，这是很大的突破。在以前的研究中，马铃薯茎中淀粉质体绿色荧光蛋白（GFP）的浓度不到叶子中的1%。胡萝卜培养细胞原质体和成色素体中BADH的活性分别是叶子叶绿体中的53.1%和74.8%。这项研究中使用的调控序列是16srRNA启动子、T7基因10的5’非翻译区、rps16的3’UTR，它们在所有的组织类型中都发挥功能，包括原质体、成色素体和叶绿体。这些研究结果表明，胡萝卜可以用来表达大量的疫苗抗原或其他治疗性蛋白质，而且服用起来也更加方便。

棉花质体基因组的转化

棉花(GossypiumhirsutumL.)是世界上最重要的天然纺织纤维的来源，也是世界上最重要的经济作物之一。美国的纤维产量占世界的40%（年销售额61亿美元），是世界上原棉的主要输出国之一。联合国粮食农业组织（FAO）报告显示，2003年棉纱布和棉籽等的产值入围美国主要农产品20强。根据国际农业生物技术应用服务组织(ISAAA)统计显示，美国经济中与棉花相关的贸易每年为1,200亿美元，棉花成为美国最有价值的农作物。然而，对棉花的体外基因操作非常困难，通过体细胞胚胎发生方式不容易产生植株。

2002~2003年，通过细胞核基因组工程改造的抗虫和抗杂草的转基因棉花的种植占世界棉花种植的13%，而大豆是63%，玉米是19%。同期相比，美国77%的区域种植了基因改良（GM）棉花，而GM大豆是81%、GM玉米是40%。细胞核转基因棉花只是在某些区域被限制的种植。陆地棉（Gossypiumhirsutum）和夏威夷棉（Gossypiumtomentosum）、弗罗里达群岛的陆地棉野生种群或者维尔京群岛和波多黎各陆地棉/海岛棉在一块都会产生杂交。因此，必须严格划定一些区域进行转基因试验，在这些区域种植商业化的抗虫棉花（Bt-cotton）。类似的，GM棉花也只能在特定的区域种植，避免使其与野生型亲缘植物共存，防止远源杂交形成亲缘关系近的杂草。

有报道称，转基因棉花的花粉可以扩散到周围非转基因棉花上。Umbeck等人在研究花粉从转基因棉花到传统棉花区域的扩散问题时发现，尽管有缓冲带隔离，它们之间仍有5.7%的互相杂交率。叶绿体基因工程可以避免转基因棉花中的基因逃逸现象，因为叶绿体转基因是通过母系遗传的。对于表达Bt毒素的GM农作物，研究人员还关心另外一个问题，毒素没有形成终产物，害虫可能产生抗Bt的抗性。另外，利用细胞核基因工程产生抗虫棉花对外源基因的表达量太低，不能有效保护植株不受害虫的侵害，还必须结合其他几种喷雾杀虫剂进一步减少害虫造成的损失。

Kumar等人最近证明，可以对棉花质体进行基因转化，获得稳定的母系转基因遗传。体外产生的转基因棉花系与非转基因的植株在栽培室中以相似的条件生长，叶绿体转基因棉花和未基因转化的棉花没有任何区别，从初花、开花、结桃，到种子成熟，都没有任何异常。F1子代十字杂交（非转基因-转基因）的种子能在卡那霉素选择性培养基上发育，但是不能长大，而转基因种子能够抗卡那霉素正常的生长，长出很多的根和叶。这进一步证明了先前棉花叶绿体基因组不是通过父系或者双亲遗传，而是通过母系进行遗传的结论。叶绿体转基因植株自授粉的种子可以在卡那霉素上生长，因此这些种子试验是非孟德尔式遗传。

大豆质体基因组的转化

大豆（GlycinemaxL.Merr.）是豆科农作物，也是蛋白最主要的来源，是人类和动物最普遍的食物之一。干大豆含大约20%的油和35~40%的高营养蛋白。大豆也是一个重要的GM农作物，GM大豆的种植占2003年世界大豆种植的一半以上，农民愿意种植这种草甘膦耐受的细胞核转基因株。更多的工作致力于改造抗害虫工程株，并提高抗病能力和油的质量。尽管尚无报道，如果利用大豆质体基因工程得到这些工程株，就会取消只能在特定区域内种植转基因大豆的限制，因为大豆质体基因组同样也是母系遗传的。

组织培养是大多数植物基因转化中至关重要的一步。因为能够发育成完整植株，体外培养的大豆胚胎发生组织是点轰击方法进行细胞核基因转化的最常用材料。然而，像它的坚硬豆荚一样，对大豆进行基因转化仍然十分困难。大豆胚胎发生过程中未分化细胞仅包含少量的十分微小的质体，因此对大豆叶绿体进行基因转化很困难。基因组数据库中还没有大豆质体基因组全序列，这也是大豆质体基因转化的一个很大障碍。

Zhang等人首先尝试进行大豆叶绿体的基因工程，他们希望提高大豆的光合作用能力。Dufourmantel等人最先利用体细胞胚胎发生方法成功实现大豆叶绿体基因工程，他们得到了可育的叶绿体转基因植株。其转化效率非常高，每次轰击得到2个转化，是马铃薯、西红柿、拟南芥中叶绿体基因转化效率的15~100倍。表型正常的转基因植株可以通过体细胞胚胎发生得到。所有叶绿体转基因植株都是完全可育的，并且其产生种子也可育。T1后代全部具有抗生素抗性，这说明转基因是稳定的，并且是通过母系遗传。

引入抗生素抗性基因，用细菌调控元件控制这个基因，这样更容易被公众接受。可以对大豆设计选择性标记，如除草剂抗性基因或者BADH。但是，选择性标记有其局限性，除草剂抗性基因不能用来进行第一轮筛选，奇霉素选择性对一些作物是致死的，棉花就是其中之一。BADH不能应用在内源的氨基乙酸三甲铵乙内酯表达量高的作物上。这里只是提供了另外一个选择，不同系统对标记的清除能力不同，取决于两个直接重复间的同源重组，或者是位点特异重组系统，如Cre-Lox，或者是完全清除整合标记基因。

主要农作物中质体基因转化成功的原因

虽然上述几种农作物要进行基因转化都非常困难，但是最近这些物种都获得了高效质体基因转化。马铃薯、西红柿和油料作物Lesquerella叶绿体基因转化的载体包含烟草或者拟南芥叶绿体的前后端序列，可能是导致这些农作物基因转化效率低的原因。烟草质体基因转化用的是自身的前后端序列，其效率非常高。用矮牵牛花的前后端序列进行烟草叶绿体基因转化时，转化效率急剧下降。其他几个例子用的是非100%同源的质体DNA序列，质体基因转化效率也非常低。因此，虽然万能载体的概念已经提出几年了，可以用来转化几个亲缘关系近的作物（例如，烟草、西红柿和马铃薯），但是还需要物种特异载体进行质体基因转化，尤其是那些比较挑剔的物种。这样的研究需要预先知道相关作物叶绿体的基因组序列。不幸的是，在已经发布的40多个叶绿体基因组和200多个正在测序物种中，只有6个是农作物叶绿体的基因组。

要了解和操作体细胞胚胎发生系统非常困难，利用异源质体组织繁殖，在随后的循环中转基因会失去优势。在基因转化过程中，非绿色组织中的原质体必须成为成熟的叶绿体，并且转化细胞在发育的各个阶段都必须承受选择压力。因此，最大困难是质体必须在有无光照的条件下都能够承受选择压力，并且在发育的各个时期都是这样。植物细胞经过轰击后，形成一两个成功基因转化的叶绿体细胞，这一点尤为重要。必须依靠选择压力使基因转化质体存活，而其他基因转化失败的质体在选择压力下会消失，相反，基因转化质体不断增殖并确立它们的优势地位。

棉花质体基因转化“双枪”载体可以同时携带两个基因，它们编码两种不同的蛋白质，共抗同一种或同一类毒物，其调控信号在原质体和成熟的叶绿体中都起作用。基因aphA-6和aphA-2(nptII)都编码氨基葡糖苷磷酸转移酶家族蛋白，但是它们起源于不同的原核生物。

两种酶有着类似的催化活性，aphA-6的基因产物还能够解毒卡那霉素，并且能对广谱的氨基葡糖苷解毒，包括氨基羟丁基卡那霉素A。两种转基因(aphA2或nptII和aphA6)都被全长的质体Prrn启动子转录，这个启动子包含细胞核和质体编码的两种RNA多聚酶，因此可以认为它在原质体中和成熟叶绿体中都发挥作用。基因aphA-6也被T7基因10的5'UTR进一步调控，从而它能够在黑暗的条件下，在非绿色组织的原质体中高效表达。rps16的3'UTR用来稳定基因aphA-6的转录。把T7基因10的5'UTR和rps16的3'UTR使BADH在胡萝卜叶子叶绿体中的表达升高看作100%，那么在含有叶绿体的可食用的非绿色组织中的表达升高为74.8%（在地下黑暗的环境中），在原生质体中的表达升高为48%。因此可以认为，非绿色和绿色质体中的基因aphA6在有无光的条件下都会表达。

棉花质体基因转化载体中的nptII基因被psbA5'和psbA3'UTRs驱动，已经多次证明这些序列以光依赖的方式对整合转基因的质体表达进行调控。从而可以作出推测，卡那霉素在有光无光的条件下都会被降解。因此，aphA-6和aphA-2基因联合在原质体和叶绿体中通过光信号进行调节，在选择压力存在的条件下持续对质体/叶绿体的转化基因提供保护。利用单基因的调控序列，尽管转基因在不同类型的质体中都能有效的表达，但是棉花的单个基因的转化效率仅为5%，大大低于“双枪”载体的42%。与之不同的是，光调节因子（rbcL5'UTR和psbA3'UTR）驱动的单个选择标记基因（aadA）对大豆的质体基因转化效率很高，因为转化时轰击的原始材料已经是绿色，含有成熟叶绿体，并且支持光合作用活性。

胡萝卜和棉花具有较高基因转化效率可能还有一个原因，载体的前后端序列比较长，其中有叶绿体DNA的复制起始点，从而为转基因整合提供更多的模板。例如，分别用具有oriA的叶绿体载体和没有oriA的叶绿体载体轰击培养的烟草细胞，只是那些有oriA的载体整合到trnI基因上，载体上的转基因被表达，产生很高的氯霉素乙酰基转移酶（CAT）活性。同样用两类叶绿体载体携带相同的基因分别轰击细胞，具有oriA的载体整合到基因trnI的侧序列，甚至可以在第一轮筛选中形成同型异源体。烟草叶绿体基因组的复制起始点已经被定位，oriA位于基因trnI中；基因trnI在棉花和胡萝卜基因转化中位于叶绿体转化载体的5’端上游。另外，这个有转录活性的空白区域是转基因整合的首选位置，在这个位置进行的转基因大大多于其他位置。

质体基因转化改善了重要农作物的性状，也有利于生产生物材料和治疗性蛋白质，如抗体、生物药物和疫苗抗原，等等。通过转基因叶绿体的高水平基因表达，可以生产大量低成本的治疗性蛋白质。像层析法这样的纯化方法在这儿根本不需要，口服治疗性蛋白质根本不需要进行纯化。正因为如此，几家主要的生物技术公司已经启动研究项目，目的是把这项技术商业化。

最近的研究认为，利用体细胞胚胎或胚胎发生愈伤组织产生质体基因转化系统的意义十分重大，很有可能会开创几种主要农作物质体基因组工程，它们需要通过体细胞胚胎发生实现植株再生。在很多作物上都已经实现了用体细胞胚胎发生的方式实现植株再生，包括谷类、豆类、油类作物、商品作物、蔬菜作物、水果/树和坚果、饮料、木材，等等。

另外，质体基因转化已经成为研究质体发生和功能的一个有力工具。这个工具被用来研究质体DNA复制起始点、RNA编辑元件、启动子、RNA稳定因子、多顺反子加工、内含子成熟、翻译元件和蛋白质水解、一些重要蛋白质和其他几个过程。因此，最近的进展对这些方面来说都是很好的开端，包括用转基因质体生产治疗性蛋白质、疫苗和生物分子，用无污染方法改良农作物，对质体的生物化学和分子生物学有更深入的了解。