双缩脲反应是肽和蛋白质所特有的，而为氨基酸所没有的一种颜色反应。一般分子中含有两个氨基甲酰基（即肽键：-CO-NH-）的化合物与碱性溶液作用，生成紫色或者蓝紫色的络合物。

在碱性溶液（NaOH）中，双缩脲（H2NOC-NH-CONH2）与铜离子（Cu2+）作用，形成紫红色络合物（该物质的分子结构式见图），该反应即双缩脲反应。

铜溶液作用，就会形成紫色或蓝紫色络合物。

注：除-CO-NH-有此反应外，酰胺基（-CO-NH2）、亚甲基（-CH2-）、亚氨基（-NH-）、（-CS-CS-NH2）等基团亦有此反应。值得注意的是，发生双缩脲反应，一般需要含有两个或两个以上的肽键（-CO-NH-），或与它类似的结构，二肽不能发生双缩脲反应。例如，甘氨酰甘氨酰甘氨酸（Gly-Gly-Gly，一种三肽，含有两个肽键）和双缩脲（biuret）结构相似，可以发生（positive response）双缩脲反应；而甘氨酰甘氨酸（Gly-Gly，一种二肽，含有一个肽键），不能发生（negative response）双缩脲反应（图1）。

由于蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键，因此也能与铜离子在碱性溶液中发生双缩脲反应，且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关，故可用双缩脲法测定蛋白质的含量（借助分光光度计可减小误差）。

双缩脲反应主要涉及肽键，因此受蛋白质特异性影响较小。且使用试剂价廉易得，操作简便，可测定的范围为1～10mg蛋白质，适于精度要求不太高的蛋白质含量的测定，能测出的蛋白质含量须在约0.5mg以上。双缩脲法的缺点是精确度低、所需样品量大。干扰此测定的物质包括在性质上是氨基酸或肽的缓冲液，如TrIs缓冲液，因为它们产生阳性呈色反应，铜离子也容易被还原，有时出现红色沉淀。

双缩脲试剂由NaOH溶液（0.1g/mL）和CuSO4溶液（0.01g/mL）配制而成，配制比例为5：1。但是双缩脲试剂不用现配现用，可以在蛋白质溶液中先加入NaOH营造碱性环境，再加入CuSO4。这是与斐林试剂不同的地方。