甲壳动物的
卵巢发育主要是通过卵黄发生过程合成卵黄蛋白原(vitellogenin,Vg),进而在卵母细胞中积累卵黄体和脂滴。卵黄体主要由卵黄磷蛋白(vitellin,Vn)组成,其含量占卵黄体的90%左右,Vn主要由卵黄蛋白原、
脂类、
碳水化合物和
色素等物质加工而成。Vn的主要合成和积累部位为卵巢组织,而Vg的合成位点具有一定的种间特异性,主要包括
卵巢、肝胰腺和脂肪体等组织。
卵黄磷蛋白的概述
甲壳动物的卵巢发育主要是通过卵黄发生过程合成卵黄蛋白原(vitellogenin,Vg),进而在卵母细胞中积累卵黄体和脂滴。卵黄体主要由卵黄磷蛋白(vitellin,Vn)组成,其含量占卵黄体的90%左右,Vn主要由卵黄蛋白原、脂类、碳水化合物和色素等物质加工而成。Vn的主要合成和积累部位为卵巢组织,而Vg的合成位点具有一定的种间特异性,主要包括卵巢、肝胰腺和脂肪体等组织。由于甲壳动物的卵黄发生的调控过程相当复杂,通常受到
内分泌系统、营养条件、环境因子等影响,尚不清楚其内在的调控机制,因此这方面的研究已成为甲壳动物繁殖生物学和生理学的研究热点和难点之一。此外,甲壳动物的卵黄积累的多少直接影响到其后生殖过程和幼体质量,因此深入研究卵黄发生的调控机制对于经济甲壳动物的人工繁殖和养殖具有重要的现实意义。
卵黄磷蛋白的生化特性
Han、Shimizu、Lubzens等对甲壳动物的研究表明,卵黄磷蛋白属于仅存在于雌性个体的一种高密度脂蛋白,分布于卵巢中的卵母细胞、输卵管、雌性血淋巴、肝脏及胚胎中。其英文名称除Vitellin之外,还有Vitellogenin,前者存在于卵巢及胚胎,后者存在于肝脏与血淋巴,虽然二者存在部位不同,但具有相同的免疫原性,由2~8个亚基组成,其分子量在240KD~800KD之间。如布纹藤壶糊斑亚种(Balamusamphitrits)、对虾属一种Penaeus monodon中仅有一种卵黄磷蛋白,分子量分别为255KD、492KD;中国对虾(P.chinensis)中存在两种卵黄磷蛋白,分子量分别是380KD、500KD;罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)中含三种免疫等同的卵黄磷蛋白,分子量分别为255KD、350KD、492KD。
电泳后用PAS、苏丹黑B等特异染色结果表明,该蛋白质为糖-脂-磷复合蛋白,有的种类还含有类
胡萝卜素。Komatsu研究结果表明:类胡萝卜素的存在可以影响该蛋白的颜色,除绒螯蟹属(Ericheir)蛋白复合体呈紫色(在波长600-650nm处有吸收值)外,其它甲壳动物复合体均呈橙色。Chang和Lubzens的研究结果表明卵黄磷蛋白亚基内及亚基之间不存在二硫键,但不同组织来源的脂类组成及其含量有差异,如肝脏合成的卵黄磷蛋白
甘油三酯含量较卵巢合成的丰富,并携带有微量的
甘油二酯。Qiu等发现甲壳动物卵黄磷蛋白随卵母细胞发育成熟而增加,而淋巴中含量较稳定,种属间氨基酸组成相似,且含有较高水平的酸性氨基酸,等电点约为5.0。
Komatsu等从笔缘扇虾(Ibacus ciliatus)卵细胞中分离到一种分子量在8KD~15KD之间,具有蛋白酶活性的LDL蛋白,卵黄磷蛋白经LDL作用可以促进自身的水解。
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明,消化后的卵黄磷蛋白释放出一100KD的具有蛋白酶活性的亚基,但天然状态下不具有酶活性。即天然卵黄磷蛋白具有潜在的蛋白酶活性,其活性在LDL蛋白消化后表现出来,两者可能协同参与肝胰腺中同种蛋白进入卵黄颗粒的加工过程。
Khayat等建立了
短沟对虾(P.semisulcatus)卵黄发生期卵巢、肝胰腺抽提物的
cDNA文库,两文库均含有一1.1Kb的电泳主带,推断这两种来源的蛋白复合物极有可能为同一基因的表达产物。
卵黄磷蛋白的合成部位及其调节因子
Lepore等通过对蔓足亚纲两种藤壶卵黄发生期卵母
细胞超微结构的观察,将卵黄发生分为初级与次级两个阶段。初级卵黄发生阶段仅存在胞内来源的卵黄颗粒,卵黄磷蛋白靠卵母细胞内大量的
粗面内质网合成,这一阶段细胞质中存在大量的
游离核糖体、粗面内质网及线粒体等,为卵黄磷蛋白的合成提供了必要的条件;次级卵黄发生阶段卵黄磷蛋白存在胞内与胞外两种来源,胞外来源由肝胰腺合成后经血淋巴转运至卵巢中,经卵膜透明带微胞饮作用摄入细胞内;胞外来源途径已由Mohamed在印度对虾(P.indicus)卵黄发生晚期观察到脂类等成份进入细胞内以及卵膜透明带上微胞饮泡的形成得到了证实,王兰对长江华溪蟹卵母细胞卵黄发生的超微结构研究结果也表明卵黄磷蛋白的合成有胞内与胞外两种途径,各种细胞器都积极参与了卵黄磷蛋白的合成。
Chang等对对虾属一种P.mondon的研究表明,胞外合成的卵黄磷蛋白经微胞饮作用进入卵母细胞,而后解离成两个亚基,其中分子量较大的亚基部分降解后与较小亚基结合而转变为卵巢中成熟的卵黄磷蛋白。此外王玉凤等对
罗氏沼虾卵黄发生过程中细胞器活动的观察结果表明,细胞核是
卵黄蛋白合成的基础,核糖体是其合成的主要场所,溶酶体、内质网、线粒体、微丝均参与了卵黄蛋白的合成,且线粒体可直接演变成卵黄粒。总之,甲壳动物卵黄磷蛋白最初均由卵母细胞自身合成,到了卵黄发生晚期才具有两种来源,而且不同种属个体两种来源存在差异,如
短沟对虾主要靠卵母细胞自身合成,其卵巢中合成速度比肝胰腺中高23倍。
卵黄磷蛋白的前体
甲壳动物Vg的结构,理化性质卵黄蛋白原(Vitellogenin,Vg)是一种普遍存在于卵生非哺乳动物血液中的雌性特异性蛋白,是几乎所有卵生动物中卵黄蛋白(Yolk protein)的前体。在十足类中主要是作为
载体蛋白进入卵母细胞为胚胎和早期幼体提供必须的营养物质。甲壳动物卵黄蛋白原的分子量在280kDa左右,有2~4个亚基组成,通过SDS-PAGE分析确定Vg中亚基的数量和大小是随着种类不同而变化的。其分子内N-端是由1100个残基组成脂磷蛋白I部分,中间是由富含磷酸化的丝氨酸的高磷蛋白部位,C-段是脂磷蛋白、卵黄磷蛋白和卵黄糖蛋白部位。卵黄中的脂类物质主要是磷酯(脑磷脂和卵磷脂)和中性脂(甘油三脂和胆固醇),卵黄中的糖类物质主要是中性粘多糖。
卵黄磷蛋白结合位点
甲壳动物Vg/Vn合成位点一直以来,甲壳动物卵黄蛋白员的合成部位都是人们研究的热点。一些十足类甲壳动物的研究结果显示,Vg的合成是内源的或外源的或同时存在的。内源性卵黄是指卵黄蛋白在卵母细胞中合成的,外源性卵黄是指卵黄蛋白在卵母细胞以外的地方合成,释放到血淋巴中,然后被卵母细胞吸收。迄今未止,在甲壳动物内推测可能的卵黄蛋白原合成部位的有:血细胞、皮下脂肪体、肝胰腺和卵巢,其中肝胰腺和卵巢是公认的主要的合成部位。研究表明,在一些种类中,Vg是在卵巢中合成的,Browdy等认为卵巢是短沟对虾唯一的卵黄蛋白原合成部位。Fainzilber等研究短沟对虾的卵黄蛋白原的合成时,也认为卵巢是其主要的卵黄蛋白原合成部位。Yano和Chinzei在做组织和免疫化学观察时发现,早期的
滤泡细胞有直径增大和卵黄磷蛋白的出现,这些都说明卵巢中的滤泡细胞应该是卵黄的合成部位。而肝胰腺中合成的蛋白与抗卵黄磷蛋白血清没有沉淀反应,所以他们认为肝胰腺不是卵黄合成的场所。一些甲壳动物种类中,Vg在肝胰腺中合成。如
锯缘青蟹、普通滨蟹、地溪蟹、短沟对虾、
日本对虾以及小龙虾的肝胰腺和卵巢中都有Vg的合成。这些研究结果存在很大的争议,不仅不同种甲壳动物的研究结果不尽相同,就是同一种甲壳动物由不同学者得出的结论也不完全相同。