逆流色谱法（CCC）原理是基于样品在两种互不混溶的溶剂之间的分配作用，溶质中各组分在通过两溶剂相过程中因分配系数不同而得以分离。是一种不用固态支撑体的全液体色谱方法。根据其发展历程分为液滴逆流色谱（DCCC）、离心液滴逆流色谱（CPC）和高速逆流色谱（HSCCC），其中高速逆流色谱（HSCCC）应用最为广泛。

逆流色谱法法（CCC）原理是基于样品在两种互不混溶的溶剂之间的分配作用，溶质中各组分在通过两溶剂相过程中因分配系数不同而得以分离。是一种不用固态支撑体的全液体色谱方法。

液滴逆流色谱是在逆流分溶法基础上创建的色谱装置，可使流动相呈液滴形式在固定相间交换，促使溶质中各组分在两相之间进行分配，达到分离效果。该法缺点是流动相流速低，每小时只有十几毫升；分离过程长，一般需要几十小时才能完成一次几个组分的分离．

比DCCC进步的地方就是使用离心加快重力分离。离心液滴逆流色谱更通用的叫法是离心行星色谱，使用很小的直管和毛细管（用多性塑料制成多层的）。一套实用的仪器包含数以千计的直管，可以获得几百个理论塔板数的效能。CPC的缺点和DCCC相似，只是用离心代替了地球重力分离。另外，CPC还多了个缺点，就是它在流动相的进口和出口必须使用旋转流体密封件；而这些密封件性能不好，价格又高，容易损耗，并且限制了泵液的压力，进而限制了流速和离心速度。

高速逆流色谱技术是一种不用任何同态载体的液-液色谱技术，其原理是基于组分在旋转螺旋管内的相对移动而互不混溶的两相溶剂间分布不同而获得分离，其分离效率和速度可以与HPLC相媲美。

高速逆流色谱是在1982年，美国国立卫生院的一个教授首先研究和发展起来的一种不同于传统液相色谱法的现代色谱分离制备技术。作为一种新的色谱技术，HSCCC分离系统可以理解为以螺旋管式离心分离仪代替HPLC的柱色谱系统。HSCCC不使用固相载体作固定相, 克服了固相载体带来的样品吸附、损失、污染和峰形拖尾等缺点。由于不需要固定相，HSCCC技术具有进样量大、无不可逆吸附等优于其他色谱技术的优点，此项技术已经被广泛地应用于医药、环境、化工等领域。

高速逆流色谱分离原理结合了液液萃取和分配色谱的优点，是一种不需任何固态载体或支撑的液-液分配色谱技术，其基本分离原理与其他同类色谱技术相同，主要是利用物质在两相间分配系数的差别进行分配。而HSCCC将两溶剂的分配体系置于高速旋转的螺旋管内，螺旋管的运动形式，是在自身自转的基础上，同时绕一公转轴旋转，形成行星运动。由此加在分配体系上的离心力场不断发生变化，使两相溶剂充分的混合和分配，从而达到洗脱分离目的。因为样品中各组分在两相中分配系数不同，导致组分在螺旋柱中的移动速度不同，因而能使样品组分按分配系数的大小次序被依次洗脱下来的一种色谱分离技术。在流动相中分配比例大的先被洗脱, 在固定相中分配比例大的后被洗脱。

在高速逆流色谱仪设计方面，其有两个轴，其中一个为公转轴，一个为自转轴，两个轴由一个电动机带动。仪器的公转轴呈水平方向，圆柱形的螺旋管支持件围绕此轴进行行星式运转，同时围绕自转轴进行自转。由于螺旋管柱的行星式运动产生了一个在强度和方向上变化的离心力场，使在螺旋柱中互不相溶的两相不断混合从而达到稳定的流体动力学平衡，两相分离成两层，重相占据螺旋管的每一段的外部，轻相占据每一段的内部，并且两相沿螺旋管形成一个清晰的线性界面。所以可以根据所用体系液体的流动趋势选用合适的模式，使得其中一相作为固定相保留在螺旋管中，另一相作为流动相并带着样品(溶质) 进入螺旋柱并不断反复穿过固定相。这一过程频率极高，当柱心以800r /min旋转时，频率超过每秒13次。流动相从固定相流动的相反方向泵入，以阻止固定相的运动，使固定相保留在色谱柱内，高速逆流色谱法就是利用了这种现象来实现高速分离的。

HSCCC是利用溶质在不同溶剂中的分配的分配系数不同进行分离的，所以在溶剂选择时要重点考虑溶质在两溶剂中的分配系数，那么其分离物质的关键是溶剂系统的选择。对于分离的溶剂体系, 应该满足以下几方面的要求：1)不造成样品的分解与变性，且不与之发生反应；2)对样品有足够高的溶解度；3)样品在溶剂体系中有合适的分配系数值(K应在0.5-2之间)；4)溶剂体系的各组分应分成体积比例适合的两相, 以免浪费溶剂；5)固定相能实现足够高的保留，且要满足一定的要求(保留值越大峰形越好)。因而准确测定待分离组分在两相中的分配系数，便可选择出合适的溶剂系统。

常见的溶剂体系按极性分类有以下几种：1) 强极性溶剂体系；2) 中等极性溶剂体系；3) 弱极性溶剂体系；4) 极弱极性体系(无水体系)；5）加酸体系等。这五种溶剂体系分别可以用于分离相应性质的天然产物。

1、强极性体系

正丁醇体系：该体系的基本两相由正丁醇和水组成，可根据需要在上下两相中加入不同体积比且极性位于正丁醇和水之间的惰性溶剂来调节溶剂系统的极性。一般加入甲醇、乙醇、丙酮作为调节剂，组成三元溶剂体系。该体系一般不是很常用。

醋酸乙酯体系：该体系是HSCCC分离常用的体系之一，基本两相由醋酸乙酯和水组成，可根据需要在上下两相中加入不同体积比且极性位于醋酸乙酯和水之间的惰性溶剂来调节溶剂系统的极性。一般加入甲醇、乙醇、正丁醇作为极性调节剂，组成三元或四元溶剂体系。用该类溶剂系统分离的物质基本上都属于苷类， 且大多数苷的苷元都比较简单，多数含有多个羟基，有的苷含有多个糖，常用于分离黄酮苷、苯丙素苷以及一些皂苷。最常用的溶剂体系有：醋酸乙酯-正丁醇-水、醋酸乙酯-甲醇-水、醋酸乙酯-乙醇-水、醋酸乙酯-正丁醇-乙醇-水。这些常用的体系极性相差不大，只有醋酸乙酯-乙醇-水的极性稍微小点，不常用于分离含有多个糖的苷。

2、中极性体系

甲基叔丁基醚体系：该体系的基本两相由甲基叔丁基醚和水组成，可根据需要在上下两相中加入不同体积比且极性位于甲基叔丁基醚和水之间的惰性溶剂来调节溶剂系统的极性。一般加入正丁醇、甲醇、乙醇、乙腈作为极性调节剂，组成四元溶剂体系，三元的甲基叔丁基醚体系不是很常见。可以用于分离含羟基不是很多的苷类和极性较大的萜苷，以及含有多个羟基和羧基的非苷类物质。甲基叔丁基醚体系和醋酸乙酯体系的极性相差很小。

氯仿体系：该体系是HSCCC分离常用的体系，基本两相由氯仿和水组成，可根据需要在上下两相中加入不同体积比且极性位于氯仿和水之间的惰性溶剂来调节溶剂系统的极性。一般加入正丁醇、甲醇、乙醇作为极性调节剂，组成三元或四元溶剂体系。其中运用最多的是氯仿-甲醇-水体系，氯仿体系可用于分离含有糖的苷, 也可分离不含有糖且含有一些羟基的苷元。但是甲醇在溶剂体系中的比例很接近或者大于氯仿在溶剂体系中的比例时，氯仿-甲醇-水体系可以分离含有多羟基的苷类物质，其极性甚至可以达到与醋酸乙酯体系极性似的程度。常用于分离黄酮、苯丙素、蒽醌、多酚及其苷。

3、弱极性体系

正己烷体系: 该体系是HSCCC分离常用的体系之一，基本两相由正己烷和水组成，可根据需要在上下两相中加入不同体积比且极性位于正己烷和水之间的惰性溶剂来调节溶剂系统的极性。一般加入正丁醇、甲醇、乙醇、醋酸乙酯、乙腈、氯仿作为极性调节剂，组成三元或四元溶剂体系。其中运用最多的是正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水、正己烷-醋酸乙酯-乙醇-水、正己烷-甲醇-水、正己烷-乙醇-水、正己烷-醋酸乙酯-水。一般用正己烷体系分离小极性非苷类物质，被分离物质中极性基团很少。常用于分离黄酮、苯丙素、蒽醌和一些萜类化合物。其中正己烷-甲醇-水、正己烷-乙醇-水分离物质的极性很小，基本不含羟基。而正己烷-醋酸乙酯-水分离的物质极性最大，可以分离含有多个羟基的物质，甚至能分离苷类。而正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水、正己烷-醋酸乙酯-乙醇-水，这两个溶剂体系的分离极性范围很广。

石油醚体系: 该体系的基本两相由石油醚和水组成，可根据需要在上下两相中加入不同体积比且极性位于石油醚和水之间的惰性溶剂来调节溶剂系统的极性。一般加入甲醇、乙醇、醋酸乙酯作为极性调节剂，组成三元或四元溶剂体系。其中运用最多的是石油醚-醋酸乙酯-甲醇-水。用该体系分离的大多数物质都不含有羟基，很少用该体系分离苷类物质，只有当苷元分子较复杂且极性很低时可以用于分离由该苷元组成的苷。降低石油醚的比例，也可以分离一小部分的苷。

4、极弱极性体系(无水体系)

大多数用于HSCCC分离的无水体系都是用乙腈代替水与小极性溶剂组成基本两相，再根据需要在上下两相中加入不同体积比且极性位于小极性溶剂和乙腈之间的惰性溶剂来调节溶剂系统的极性。该溶剂系统可以用来分离极性非常小的物质，这种物质一般含有较多碳，基本上不含有极性基团，适用于分离小极性的甾体、萜类以及多碳烷烃。常见的无水体系有正己烷体系，其基本两相由正己烷和乙腈组成。

5、加酸体系

在极性相对小的溶剂体系中加入酸碱会增大溶剂体系的极性。常在溶剂体系中加入盐酸、醋酸、三氟乙酸、磷酸盐。这种加了酸碱的溶剂体系常用于分离具有酸碱性质的物质，如生物碱、有机酸和酸性较强的黄酮类化合物。氯仿-甲醇-稀盐酸溶剂体系就常常用于分离生物碱类的物质，可以说氯仿-甲醇-稀酸体系是分离生物碱的专用体系。

选取一个合适的溶剂体系步骤：(1) 通过TLC或者HPLC预测被分离物质的极性。(2) 根据极性选择合适的分离体系。(3) 如果得知与被分离物质极性相似物质的分离体系，可以借鉴。在选择溶剂系统时就需要测定组分的分配系数, 而分配系数测定常采用高效液相色谱法或薄层色谱法，这两种方法都能够较准确地测出特定组分的分配系数值。HPLC法是将适量的样品分别溶于已平衡的两相溶剂，待分配平衡后，进行HPLC的测定，通过得到的色谱峰面积可精确计算出样品在两相间的分配系数。薄层色谱法则是利用样品在等体积上下相中分配平衡后用薄层色谱展开, 通过薄层色谱得到的斑点判断组分的分配情况。不同的体系，有着不同的平衡时间(不同溶剂系统中，从两相溶剂系统的上相与下相溶剂混合时，直到两相系统达到完全分层的时间)，其影响着系统的分离效能，与固定相的保留率密切相关。

如果要同时分离多种物质，首先要预测被分离物质的极性，根据极性的大小来选择分离体系。如果被分离物质的极性都比较大, 可以选用醋酸乙酯体系；如果被分离物质一部分极性大，一部分极性中等可以选用氯仿体系；如果被分离物质一部分极性中等，一部分极性较小可以选用正己烷体系；如果被分离物质极性都较小可以选用石油醚体系。

在进行分离纯化时，首先将固定相充满于色谱柱，而后色谱柱即围绕自身轴进行自转；同时围绕设备中心轴进行高速公转(即行星式运动)，再将流动相泵入色谱柱。在此之前，首先选择预先平衡好的两相溶剂中的一相为固定相，并将其充满螺旋管柱，然后使螺旋管柱在一定的转速下高速旋转，同时以一定的流速将流动相泵入柱内。在体系达到流体动力学平衡后(即开始有流动相流出时)，将待分离的样品注入体系。进样时，将样品组分溶于一定体积的的流动相之中，其组分将依据其在两相中分配系数的不同实现分离。同时，在注入固定相和流动相前，需配制溶剂系统，充分振荡后静置过夜；分离上下层溶剂，超声排气30min。而测试结束后用氮气将固定相推出, 可测得保留率，有时由于固定相的流失导致流出液乳化，一般要求固定相的保留值大于50%。

由于高速逆流色谱是无需任何固态载体支撑的液-液色谱,其中作为固定相的液体在色谱柱中的保留程度对于高速逆流色谱的分离过程是十分重要。首先，所选择的溶剂体系对固定相保留率有很大的影响，如两相密度差、粘度、界面张力等。两相的密度差对固定相保留率的影响最大，固定相保留率和密度差基本呈线性关系。其次，还存在一些人为可以操控的条件会对固定相保留率产生影响，如高速逆流色谱的转速、流速、以及柱温等。其中，螺旋管柱的转速以及它产生的离心力场对两相的混合程度具有决定性的影响。因此，对于界面张力较高的溶剂系统，应使用较高的转速，以使两相之间能够剧烈的混合，从而促进分配和减少质点传递的阻力。对于界面张力较低的溶剂系统，应使用较低的转速，以避免过分混合引起乳化作用，以及固定相的流失。

在流动相流速方面，固定相保留率与流速平方根之间有着线性关系。流动相流速快不利于固定相的保留，且出峰时间太快会导致峰与峰间的分离度较差，而低流速虽然可以满足提高固相保留率的要求，但是分离时洗脱时间太长，且峰形变宽、耗费大量的流动相，故选择合适的流速对整个分离体系非常重要。

仪器的柱温对固定相的保留同样也有着不可忽视的作用，其温度对于亲水性强的正丁醇溶剂体系的固定相保留率影响较大。同时温度升高能改变溶剂的粘度，进而影响两相的分层时间。

在选定了溶剂体系后, 有时需要对三个仪器运行参数(转速, 流动相流速, 进样体积)进行正交试验, 以确定最佳分离条件。分离是一种较为复杂的动态高速分配过程，其分离效率不仅和溶剂系统有关，还受分离温度、螺旋管转速、流动相流速、梯度洗脱模式及进样量、进样方式等因素的影响。

主要应用于天然药用植物活性成分的分离、标准品的制备、快速分离和重要指纹图谱分析以及天然新药的研发和筛选，HSCCC技术在天然产物分离中有着非常广泛的应用。