染色体步移(Chromosome walking)是用于鉴定已经克隆的特定
DNA片段侧翼顺序的方法。
①根据已知的基因或分子标记连续步移,获取人、动物和植物的重要调控基因,可以用于研究结构基因的表达调控。如分离克隆
启动子并对其功能进行研究;
对于
基因组测序已经完成的少数物种(如人、
小鼠、
线虫、水稻、
拟南芥等)来说,可以轻松地从数据库中找到某物种已知序列的
侧翼序列。但是,对于大多数生物而言,在不了解它们的基因组序列以前,想要知道一个已知区域两侧的
DNA序列,只能采用染色体步移技术。
以
PCR技术为基础的染色体步移的主要问题是,在预先不了解未知区域序列信息的情况下,如何设计两个
特异性引物来扩增未知区域。而传统的染色体步移方法,如:反向PCR法、连接接头法等,都有操作复杂、非特异性扩增、连接效率低等弊端。
TaKaRa新产品之Genome Walking Kit试剂盒是一种根据已知
基因组DNA序列,高效获取侧翼未知序列的试剂盒。相对于其它传统方法,本试剂盒具有高效、简便、特异性高、灵敏度高、一次性获得的未知序列较长等特点。其主要原理是根据已知DNA序列,分别设计三条同向且
退火温度较高的特异性引物(
SP Primer),与试剂盒中提供的四种经过独特设计的退火温度较低的兼并引物,即AP1、
AP2、AP3、AP4进行热
不对称PCR反应。
通常情况下,其中至少有一种
简并引物可以与特异性引物之间利用退火温度的差异进行热不对称PCR反应,通过三次
巢式PCR反应即可获取已知序列的侧翼序列。如果一次实验获取的长度不能满足实验要求时,还可以根据第一次步移获取的序列信息,继续进行侧翼序列获取。此外,本试剂盒中还含有Control
DNA及Control Primer,可以方便进行Control实验。