拷贝数,是指某基因(可以是质粒)在某一生物的
基因组中的个数。单拷贝就是该基因在该生物基因组中只有一个,多拷贝则指有多个。在细菌细胞中,根据复制特性,
质粒分严紧型和松弛型两类,前者在细胞中只含1〜2个,而后者含10〜15个以上。恒定的拷贝数与质粒复制控制系统、
宿主细胞遗传背景及生长条件有关。
(一)在细菌细胞中,某种特定质粒的数目。根据复制特性,质粒分严紧型和松弛型两类,前者在细胞中只含1~2个,而后者含10~15个以上。恒定的拷贝数与
质粒复制控制系统、
宿主细胞遗传背景及生长条件有关。质粒复制控制系统首先通过调节复制的起始点来控制拷贝数,调节因素包括
阻遏蛋白、
反义RNA和某些顺向
重复序列。有些质粒还有其他控制系统,如有分配功能的par系统和确保质粒
稳定遗传的ccd系统。一旦质粒上与调控有关的基因或位点突变,可使拷贝数明显增加或减少。
Southern blot 是一种常用的
DNA 定量的
分子生物学方法。其原理是将待测的 DNA 样品固定在固相载体(
硝酸纤维膜或
尼龙膜)上,与标记的
核酸探针进行杂交,在与探针有同源序列的固相 DNA 的位置上显示出杂交信号,通过检测信号的有无、强弱可以对样品定性、定量,从而计算出转入的拷贝数。 Southern 法
准确性高、
特异性强,但存在费时费力的缺点。另外,由于 Southern 法检测不经过靶片段的扩增(
PCR ),一般每个电泳通道需要 10-30 μ g 的 DNA ,在实际操作中就需要较大量的植物材料来提取 DNA ,而
转基因植物的
愈伤组织在
无菌条件下经过筛选、重新分化后一般都比较细弱,不宜大量取样。如果
外源基因在插入时发生
基因重组,造成
限制性酶切位点丢失, Southern 法也无法检测到。这些因素都制约了 Southern 法在 T 0 代转基因植物中检测
外源基因拷贝数的应用。
其定量的基本原理是在 PCR 反应体系中加入非特异性的
荧光染料(如: SYBR GREEN I )或特异性的
荧光探针(如: Taqman 探针),实时检测荧光量的变化,获得不同样品达到一定的荧光信号(阈值)时所需的循环次数: CT 值( Cycle Threshold );通过将已知浓度
标准品的 CT 值与其浓度的
对数绘制
标准曲线,就可以准确定量样品的浓度。
荧光定量 PCR 技术具有简便、快捷的优点,能够有效扩增
低拷贝的靶片段 DNA ,对每克样品中 20pg-10ng 的
转基因成分进行有效检测。同时,与 Southern 法相比,荧光定量 PCR 技术可对
T-DNA 的不同序列进行扩增,因此能实现对转基因品系中的
基因重组的检测( Giovanna 2002 )。
数字PCR的基本原理是将含有
核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的
微滴,其中每个微滴或不含待检核酸靶分子,或者含有一个至数个待检核酸靶分子,且每个微滴都作为一个独立的PCR
反应器。经
PCR扩增后,采用
微滴分析仪逐个对每个微滴进行检测,有荧光信号的微滴判读为1,没有荧光信号的微滴判读为0(因此该技术被称为“数字PCR”),最终根据
泊松分布原理以及阳性微滴的比例,分析软件可计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数(无需标准曲线的绘制)。