数字PCR即Digital PCR(dPCR),它是一种
核酸分子绝对定量技术。相较于
qPCR,数字PCR可让你能够直接数出
DNA分子的个数,是对起始样品的绝对定量。
在
定量PCR时,我们常常纠结一个问题,究竟是
相对定量还是绝对定量呢?如今,你无需纠结了,因为数字PCR(digital PCR)来了。尽管这两种技术有些类似,都是估计起始样品中的核酸量,但它们有一个重要的区别。
定量PCR是依靠
标准曲线或参照基因来测定核酸量,而数字PCR则让你能够直接数出
DNA分子的个数,是对起始样品的绝对定量。因此特别适用于依靠
Ct值不能很好分辨的
应用领域:
拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究(如
等位基因不平衡表达)、二代测序结果验证、
miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。
20 世纪末,Vogelstein 等提出数字
PCR( digitalPCR,dPCR) 的概念,通过将一个样本分成几十到几万份,分配到不同的反应单元,每个单元至少包含一个拷贝的
目标分子(
DNA 模板) ,在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR 扩增,扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析。
数字PCR是一种
核酸分子绝对定量技术。当前核酸分子的定量有三种方法,光度法基于核酸分子的
吸光度来定量;
实时荧光定量PCR(Real Time PCR)基于
Ct值,Ct值就是指可以检测到荧光值对应的
循环数;数字PCR是最新的定量技术,基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量,是一种绝对定量的方法。主要采用当前
分析化学热门研究领域的
微流控或
微滴化方法,将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的
微反应器或微滴中,每个
反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后,有一个核酸
分子模板的反应器就会给出荧光信号,没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积,就可以推算出原始溶液的核酸浓度。