卵巢卵泡发育是指胎儿发育至6周时，始基生殖细胞（卵母细胞）已从卵黄囊中之其起源部位以阿米巴样运动移至生殖嵴（假定的卵巢）.卵母细胞通过有丝分裂迅速增殖，直到第4个月。此后绝大多数衰萎消亡。在第3个月间，有些细胞停止有丝分裂而开始成熟分裂（减数分裂）.达第7个月时，所有成活的细胞皆停止于减数分裂前期的双线期。在7~9月间，胎儿卵巢已组成，每一个卵母细胞则成为一个始基卵泡的一部分。而每个始基卵泡包含了一层基膜，单层鳞状上皮颗粒细胞和一个卵母细胞。始基卵泡组成了休止卵泡池，以后创建成一个生长池（所有的成熟卵泡都从此池发育）或萎缩。

发动卵泡与卵母细胞的生长机制尚不清楚，但并不需要促性腺激素。

女子出生时只保存了有限的卵子数，它们中的99.9%将萎缩而消亡。由于每一个卵母细胞保持抑制状态于分裂初期直到排卵，故它是体内的一个最长命的细胞(从胚胎到50岁左右)。这长命的跨度可能是高龄母亲中遗传性异常妊娠发生率增高的原因。

在妇女的生殖年岁间，每个周期在生长池内的数个卵泡参与生长,但往往只有一个被选作排卵。它发展成一个囊状卵泡，并对月经中期的LH高峰有反应；其被选择的机制尚不知晓。囊状卵泡包含一个卵泡腔(充满液体之腔)，其由增殖的颗粒细胞分泌的液体与粘多糖所建成。卵泡的增大主要是由于在FSH控制下卵泡液的积聚，FSH也诱导颗粒细胞上特有的LH受体的发育。LH受体对刺激排卵前孕酮的分泌与黄体期继续产生孕酮负责，卵泡内的颗粒细胞也促使对催乳素特有膜受体的生长，后者的数目随着卵泡的成熟而减少，它们的生理作用不明。

目的

评估机械法、酶解法和酶解?机械结合法等分离方法对小鼠移植卵巢分离卵泡的发育及其生殖潜能的影响，建立更好的卵泡分离技术方案。

方法B6D2F1新生小鼠卵巢移植后分别用机械法、长时酶解法、短时酶解法或酶解?机械结合法分离卵巢组织中的腔前卵泡，分离回收卵泡在体外培养12 d时加入绒毛膜促性腺激素(hCG)处理26 h，收获卵丘复合体进行体外受精。

结果机械法的卵泡回收量、卵泡培养残存率、排卵率均高于酶解法，短时酶解法的排卵率高于长时酶解法;酶解机械结合法的平均卵泡回收量、平均排卵数、卵母细胞成熟率等多项指标均高于其他各组。

结论酶解机械结合法是分离小鼠卵泡良好的技术方案。

卵巢 卵泡 培养技术 胚胎组织移植

人工诱导胚胎卵巢原始卵泡发育成熟可为受精机制研究和医疗性克隆提供充足的卵母细胞源。对异体移植发育到一定程度的卵巢进行生长卵泡分离是人工诱导卵泡发育的关键步骤之一[1?3]，迄今已经发展出两种卵泡分离技术，包括酶解分离法和机械分离法。这两种方法各有其缺点，使每个卵巢的卵泡回收率和成熟率均停留于较低水平。本研究探讨了酶解法、机械法和酶解?机械结合法等分离方法对小鼠移植卵巢分离卵泡的发育及其生殖潜能的影响，以期建立更好的卵泡分离技术方案。

1.1 动物 C57BL/6(B6)雌鼠、DBA/2(D2)雄鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司[合格证：SCXK(沪)2007?005]，以B6雌鼠和D2雄鼠交配繁殖B6D2F1(F1)小鼠。小鼠饲养于恒温(25 ℃)动物房单笼独立通风系统(IVC?II型，苏州市冯氏实验动物设备有限公司)，光照14 h，黑暗10 h，自由饮水取食。

1.2 试剂 α?MEM?HEPES(42360?032)，α?MEM(32571?036)，胶原酶I(17100017)，脱氧核糖核酸酶(DNaseI，18047?019)及ITS(胰岛素?转铁蛋白?硒混合物)均为美国Gibco公司产品; rFSH(注射用重组人促卵泡激素，瑞士Serono公司);LH(黄体生成素，美国Sigma公司);hCG(中国丽珠集团丽珠制药厂);FCS(胎牛血清)，penicillin/streptomycin(青霉素/链霉素)及KSOM+AA(MR?106?D)均为美国Chemicon公司产品。

1.3 卵巢移植 B6雌鼠(8～10周龄)与D2雄鼠(10周龄)4∶1合笼培育F1代，次日查到阴栓者记为E0.5 d;以20 d为孕期，预产期前3 d每日早晚查看孕鼠是否生产;断颈处死新生12 h以内F1小鼠，取出双侧卵巢待移植。异戊巴比妥(15 mg/mL)麻醉成年(8～10周)F1雌鼠(移植受体)。消毒小鼠背部，在肋脊角区做纵向切口进入腹腔，切除双侧卵巢，然后在左侧肾被膜下植入新生小鼠卵巢2枚，层层缝合伤口。待受体鼠清醒后送回鼠舍。

1.4 卵泡分离 新生小鼠卵巢移植14 d后，将受体鼠断颈处死，从肾被膜下取出移植的卵巢，卵巢移植物约2 mm大小，表面可见丰富的重构血管，在体视镜下可清晰观察到卵巢移植物中的卵泡。用1 mL注射器(320310，美国BD公司)的针尖将每枚卵巢均匀横切为2块，4块卵巢组织混合后随机分组进行分离。

1.4.1 A组(单纯机械法) 将卵巢组织块转移至卵泡分离操作液(α?MEM?HEPES，10%FCS，100 IU/mL penicillin，100 mg/mL streptomycin，不含胶原酶和DNA酶)中，在带有37 ℃恒温热盘(MATS?U55SZX2A，奥林巴斯)的体视显微镜下，用精细尖镊 (直5#，T1?181，中国淮安特申医疗器械有限公司)剥离卵巢中的卵泡。每隔5 min，即将已剥离的完整卵泡转移至事先装有1 mL卵泡培养液(α?MEM，5%FCS，0.1 IU/mL FSH，0.01 IU/mL LH，1%ITS)的35 mm培养皿中。共分离4次，总时间约20 min。

1.4.2 B组(长时酶解法) 将卵巢组织块用1 mL注射器针尖均切为3小块，置于500 μL卵泡酶解液(α?MEM?HEPES，3 mg/mL胶原酶I，1 mg/mL DNase I)中，在37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中消化20 min，第20分钟时将其从培养箱取出，用200 μL移液枪吹吸消化液30次。在体视显微镜下将游离出的结构完整的卵泡转移至事先装有1 mL卵泡培养液的35 mm培养皿中。

1.4.3 C组(短时酶解法) 将卵巢组织块用1 mL注射器针尖均切为3块，置于500 μL卵泡酶解液中，在37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中消化，每隔5 min即从培养箱中将组织取出，用200 μL移液枪吹吸消化液30次，在体视显微镜下观察是否有游离的卵泡，如有则将卵泡迅速转移至装有1 mL新鲜培养液的35 mm培养皿中。共消化20 min。

1.4.4 D组(结合法) 将卵巢组织块用1 mL注射器针尖均切成3块，转移至500 μL卵泡酶解液中，在37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中消化5 min。然后在带有37 ℃恒温热盘的体视显微镜下，在卵泡酶解液中用精细尖镊分离卵泡。每分离5 min，即将已分离得到的完整的卵泡转移至事先装有1 mL卵泡培养液的35 mm培养皿中。共分离4次，20 min。

1.5 双荧光染色 每组随机选取部分分离卵泡，放入Calcein AM(4 mmol/L，Sigma，C1359)和Ethidium Homodimer?I(10 mmol/L，Sigma，E1903)混合液中，37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养45 min;卵泡悬液置倒置荧光显微镜观察，在蓝光的激发下，活的卵泡发绿色荧光，死的卵泡发红色荧光，分别计数死、活卵泡数。

1.6 卵泡体外培养 各组分离所得卵泡分别进行体外培养12 d。第0天，分离得到的卵泡培养在加有1 mL培养液的35 mm培养皿中;第1天，加入1 mL新鲜培养液;此后每天半量换液;第12天全量换为卵泡成熟培养液(α?MEM，5%FCS，0.1 IU/mL FSH，0.01 IU/mL LH，1% ITS，1.5 IU/mL hCG);第13天，在加入卵泡成熟培养液后26 h收集排出的卵丘复合体(OGCs)。

1.7 体外受精 每组的OGCs分别行体外受精。卵母细胞受精培养4 h后从受精滴中洗出，转移至预先平衡过的KSOM+AA的小液滴中培养。观察卵母细胞的成熟率(以含有第一极体的卵母细胞百分率代表)、受精率(以双原核卵母细胞占有第一极体卵母细胞的百分率代表)。

1.8 统计学处理 采用SPSS 11.5软分析。4组的卵泡存活率、培养卵泡各阶段成熟率、排卵率运用单因素方差分析(one way ANOVA)，各组均数以最小显著差法(least significant difference, LSD)进行两两比较和显著性检验;卵母细胞成熟率和受精率采用χ2 检验。

2.1 分离卵泡回收量 经过分离操作后，显微镜下可见大量腔前卵泡，大部分卵泡呈圆或椭圆形，边界清楚，部分卵泡外周附有或多或少的卵巢间质组织，卵母细胞成圆形，位于卵泡中央，透明带清晰可见(图1A)。体视镜下回收卵泡边界清晰、光滑的卵泡，计数各组回收卵泡量(表1)。表1 各组卵泡回收量比较

2.2 双荧光染色结果 卵泡双荧光染色后，在蓝光的激发下，活细胞显示绿色荧光，死亡细胞则呈红色荧光。将卵母细胞呈绿色、卵泡细胞≥70%呈绿色者视为存活卵泡(图1B)。各组活卵泡的百分率见表2。表2 各组卵泡存活率比较

2.3 卵泡体外培养结果 每组卵泡在相同条件下培养12 d，计数5、12 d的卵泡残存率;在加入hCG 26 h后，计数排卵率。各组各项指标的结果见表3。表3 各组卵泡体外培养结果比较

2.4 体外受精结果 各组收获OGCs分别受精，获能精子密度控制在5×105 mL?1。早期胚置于KSOM+AA中培养，卵的密度为每20 μL含 15个。成熟率及受精率的计数结果见表4。D组成熟率高于其他3组，余3组之间差别无统计学意义;受精率4个组之间无差别。表4 各组体外成熟与受精结果比较

近年来，多种哺乳动物，如小鼠、兔、猪及人的卵泡诱导发育技术体系都获得了很大进展[4?7]。在这些体系中，大多倾向于将卵巢中的卵泡单独分离出来后再进行培养。有报道表明，分离卵泡只有其基底膜未受损伤并带有少量间质细胞、未成熟圆形卵母细胞位于其中央时，体外培养才能成功[8]。迄今常用的卵泡分离方法有两种，包括利用水解酶(如链霉蛋白酶、胶原蛋白酶和脱氧核糖核酸酶)消化卵巢的结缔组织而获得游离卵泡的酶解法和用锐利器械剥离出卵泡的机械法[6,9?10]。就资料来看，两种方法各有优缺点。酶解法是细胞生物学研究中分离各种组织、器官中细胞的常用方法，因其操作简便有效而受到普遍应用。酶解法分离卵泡时，普遍采用胶原蛋白酶和脱氧核糖核酸酶组合配制成分离液。这种分离液利用酶消化卵巢间质组织中的胶原蛋白，使卵泡从卵巢组织释放出来，故在限定时间里可望收获较多的游离卵泡。有报道表明，用酶解法分离卵泡培养的卵母细胞可有更高成熟率和卵裂率的趋势[11]。但是，分离液长时间浸泡卵巢组织时，显然可能导致卵泡基底膜受到损伤，从而使卵泡在后续培养中更易于退化，降低了卵泡培养的残存率，因此酶的作用浓度和时间是个关键的问题。

用机械法分离卵泡，如果操作手法得当，可能保持卵泡基底膜的完整，从而在体外培养过程中更容易维持卵泡的立体结构，保障更高的培养残存率。Carrell等和Park等的结果显示，用机械法分离的卵泡，其残存率存活率显著高于用酶解法分离者[12?13];Shen等还进一步利用机械法来源的小鼠卵泡培育成熟卵母细胞并成功制备了IVF?ET小鼠[4]。但是，也有报道表明，移植后卵巢切片显示有些腔前卵泡的卵母细胞与其周围颗粒细胞的联系很薄弱[14]。用机械法从致密的卵巢间质组织中分离卵泡时，往往难于避免牵拉卵泡的力量过大，很容易破坏卵母细胞与颗粒细胞的连接，而卵母细胞和颗粒细胞的缝隙连接异常，会影响卵母细胞的发育并导致减数分裂阻断[15?16]。故机械法能否保障卵泡存活率在很大程度上依赖于操作技巧，同时在有限的分离操作时间里很难提高卵泡的回收量。从报道来看，单用机械法从每枚卵巢中得到的卵泡数量非常有限，平均每个卵巢只有12.51和11.27个[4,14]。

本研究结果表明，酶解法的卵泡回收量、分离后卵泡培养的残存率、排卵率均低于机械法(表1，3)，但分离刚结束时的卵泡活率却高于机械法(表2)。此结果与Demeestere等的报道不符，却与Carrell等和Park等的报道相似[11?13]。说明酶解法在分离卵泡时对卵泡造成的直接损伤较少，但对卵泡的远期存活不利。值得注意的是，本研究采用酶解法分离卵泡时，设置了C组即短时酶解法，采用酶解过程中每隔5 min收获1次卵泡的改变法，而该组的排卵率显著高于常规的20 min酶解处理组，证明减少酶的作用时间是有价值的。

为了提高分离卵泡的回收量，同时又保障较高的培养残存率、排卵率和卵泡的生殖潜能，本研究建立了将酶解法和机械法相结合来分离新生小鼠卵巢移植物中腔前卵泡的技术方案。在结合法(D组)中，将卵巢组织块先在含有胶原蛋白酶和脱氧核糖核酸酶的分离液中37 ℃消化5 min，随即采用与单纯机械法相同的操作手法进行剥离，同时将剥离出的卵泡立即转移至不含酶的培养液中。此做法利用酶的消化作用使卵泡周围的结缔组织得到一定消化，卵巢组织变得比较松散，从而减少机械剥离时对卵泡的牵拉损伤，同时又使游离出的卵泡及时离开分离液，减少了水解酶对卵泡的作用时间，比单纯酶解法或单纯机械法更有利于保持卵泡的三维结构。实验结果表明，D组中分离后卵泡的存活率与单纯酶解法(B、C组)无差别，但高于单纯机械法(A组)，而每块卵巢的卵泡回收量、平均排卵数、卵母细胞成熟率多项指标均高于其他各组，说明结合法具有绝对优于两法单用的趋势。同时，采用结合法从每个卵巢移植块获得97.13个卵泡(相当于194卵泡/卵巢)其中40.66%达到排卵，显著高于国内外文献所报道的相应数据。值得注意的是，本研究用来源于4种分离方法所培育的卵母细胞进行体外受精，其受精率在各组间并无显著差异，说明分离技术只对卵泡在后续培养中的发育与成熟有影响，而对那些发育至成熟的卵母细胞的生殖潜能并无显著影响。

实验结果提示，本研究建立的酶解?机械结合法是一个良好的卵泡分离技术，对卵巢组织工程的技术进步具有实际应用价值。

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卵泡发育经过三个过程：募集、选择和优势化。一个卵泡从开始发育到最终成熟需约85天。募集过程相当于周期l～4天，其机制可能与卵泡刺激素(FSH)受体数量或卵泡局部微环境的状态等因素有关。募集对排卵是必要的，但其发生后并不一定有排卵发生。选择是指在被募集的卵泡簇中有一个卵泡发育为优势卵泡并具有排卵能力的过程。在周期的5～7天，被选择的卵泡通过其他卵泡的闭锁而最后被筛选出来。介于优势卵泡的选择和排卵之间的阶段则为卵泡的优化过程。

1．始基卵泡

直径0．03～O．06mm，每个卵原细胞具有46条染色体，进行有丝分裂，是由初级卵母细胞和其周围单层扁平的前体颗粒细胞组成。卵巢皮质内形成的始基卵泡不断地移向卵巢的髓质，为下个周期的卵泡发育提供来源。

2．初级卵泡和次级卵泡

此时单层上皮细胞转变为立方形的颗粒细胞，其中含初级卵母细胞，卵泡直径大于0．06mm。次级卵泡形成后颗粒细胞上出现了以下几个方面的重要变化：促卵泡素、雌激素和雄激素受体形成，缝隙连接形成，卵泡膜形成。颗粒细胞合成并分泌粘多糖，形成透明带。

3．窦卵泡

当卵泡直径达O．2～0．4mm时，颗粒细胞间产生液体，堆积形成腔。

4．成熟卵泡

体积显著增大，颗粒细胞层内侧液体逐渐增多，空腔亦随着增大，卵细胞移向一侧。此时卵泡芳香化酶活性进一步增强，雌二醇分泌达高峰，并可对下丘脑一垂体的周期中枢产生正反馈效应，使促性腺激素释放剧增，形成排卵前黄体生成激素(LH)峰而促发排卵。其结构从外向内依次为：卵泡外膜、卵泡内膜、颗粒细胞、卵泡腔、卵丘、放射冠。在放射冠与卵细胞之间还有一层很薄的透明带。在临近排卵前，卵丘中的颗粒细胞排列疏松。成熟型卵一冠一丘复合物的形态特征是：颗粒细胞展开，细胞之间距离加大，放射冠细胞分散，卵母细胞排出第一极体，此时为MII期卵母细胞。