PCR标记法是在PCR反应底物中，将一种dNTP换成标记物标记成dNTP的一种方法， 这样标记的dNTP就在PCR反应的同时掺入到新合成的DNA链上。这个过程通常以实验图的形式展示出来。

从固体平板挑取转化带有目的基因的单菌落，用特异引物通过聚合酶链式反应可直接扩增和标记目的基因，不需经过菌的液体培养、质粒提取和酶解反应等复杂过程，能快速获得目的基因扩增产物和进行目的基因探针的标记。

探针是核酸分子杂交及分子标记研究进行的必要前提，在Southern blot、Northern blot、ALFP、 RFLP、RAPD、SSR等技术中得到了广泛应用，在分子生物学的研究中充分发挥着作用，尤其对核酸分子操作具有十分重要的意义。因此，探针的制备与标记已成为核酸研究中最常规和普遍的技术，但目前的探针标记方法主要是将质粒或λDNA 经限制性内切酶酶解后分离目的片段，再用切口平移标记法或随机引物标记法进行标记，耗时很长且效率低，而用PCR聚合酶链式反应只须极少量的DNA模板（50～100ng），即可扩增出大量高效标记的目的片段，但仍需进行质粒的提取工作，最少也要2～3d才能完成全过程。为了进一步提高探针标记的效率，本试验进行PCR方法直接从菌中标记目的基因的研究，仅需2～3h即可获得高效率标记的探针，也可直接从具目的基因载体质粒中扩增出目的基因，同时适用于不需提取质粒DNA迅速鉴定细菌转化的转化子。 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

菌种

大肠杆菌DH5α（含有携带芜菁花叶病毒外壳蛋白基因（TuMV-cp）的表达载体质粒pBTU， npt Ⅱ筛选标记基因，Km），农杆菌R1000（Sm）， EHA105（Cm），LBA4404（Rif），以上菌种由本研究室保存。

试剂

Taq DNA聚合酶（Promega），pfu DNA聚合酶购于上海生工公司，DIG DNA Labeling and Detection Kit（Boehringer Mannheim）。PCR扩增反应引物为芜菁花叶病毒外壳蛋白基因两端序列：引物1:5’-GCG TCG ACC ATG GCA GGT GAA ACG CTT G-3’引物2:5’-TGT CGA CTT TAT TCC CGG GTC ATA ACC CCT GAA CGC C-3’上海生工公司合成。

直接从菌中扩增目的基因方法

（1）常规方法从大肠杆菌DH5α提取表达载体pBTU质粒，用冻融法转化农杆菌R1000， EHA105，LBA4404，获得转化子后提取质粒DNA。

（2）分别挑取DH5α和转化的R1000、 EHA105、LBA4404单菌落，表达载体pBTU质粒为阳性对照，在冰上加入反应液至终体积20μl （表1），PCR反应程序：95℃预变性2～3min、94℃ 变性30s、60～65℃退火30s、72℃延伸1～2min、 25～30循环、72℃最终延伸7min、-20℃保存。扩增产物在1%的琼脂糖凝胶电泳，经凝胶成像系统检测，鉴定和筛选含有目的基因的阳性转化子，用紫外分光光度计检测扩增产物的产量。

直接从菌中标记目的基因方法

（1）分别挑取具有目的基因的DH5α、R1000、 EHA105、LBA4404的单菌落，在冰上加入反应液至终体积50μl（表2），按如下程序进行PCR反应，95℃预变性2～3min、94℃变性30s、65℃退火 30s、72℃延伸2min、25～30循环、72℃最终延伸 7min、-20℃保存。

（2）在PCR扩增产物中加入5μl 5mol/L LiCl 和100μl-20℃预冷的无水乙醇沉淀，4℃， 12000r/min离心15min，70%乙醇洗沉淀，抽干后用50～100μl TE溶解，如纯度较低可通过凝胶回收纯化试剂盒纯化探针。将地高辛标记的探针进行点杂交检验，评估标记效率，PCR-Southern检测进一步验证探针的灵敏性。 表1、扩增目的基因反应体系

无菌纯水 14.9μl _ 10× 2μl 1×buffer（mg） dNTP 0.5μl 0.2mmol/L dNTP 引物 F1:0.4μl 0.1-1μmol/L F2:0.4μl 酶 Tap酶 1.0units 0.2μl 模板 1-2μl 可变总量 20μl _--

表2 标记目的的基因反应体系

_ 试剂 用量 最终浓度_ 无菌纯水 35.5μl _ 10× 5μl 1×buffer（mg） 10×dNTP 5μl 0.2mmol/L （DIG-dNTP） dNTP 引物 F1:1μl 0.1-1μmol/L F2:1μl 酶 pfu酶 2.5units 0.5μl 模板 1-2μl 可变总量 50μl _

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（1）转化的农杆菌R1000，EHA105，LBA4404 用碱裂解法提取表达载体pBTU质粒，筛选到转化子，计算转化率约为10～10。单菌落的菌体用特异引物进行PCR反应后扩增出目的基因（图1），进一步证实直接从菌中扩增目的基因片段的方法是可行的，经紫外分光光度计检测扩增产物的浓度为0.1～0.5μg/μl。试验发现某些已转化的单菌落质粒拷贝数少导致提取质粒困难，经PCR扩增反应后有些单菌落扩增出具有目的基因的转化子，其实际转化率为10～10，可见 PCR扩增反应可快速鉴定出用质料提取方法无法确定出的转化子，提高了鉴定水平和效率。

（2）单菌落的菌体用特异引物及DIG-11- dUTh进行PCR反应后扩增出目的基因，用PCR -地高辛标记的探针进行DNA斑点杂交试验证实标记成功（图2），通过标记探针与对照试验的分析估算出合成的探针量为1～3μg。

（3）用10～20ng/ml标记好的探针与大白菜转基因植株的PCR扩增产物进行Southern blot杂交，出现较强的杂交信号（图3），证明标记的探针具有很高的灵敏性和准确性。

（1）90年代初Mercier为简化PCR样品的制备过程，直接用全血的细胞作为模板扩增出目的DNA片段。1989年Koch等发明了一种引物介导的原位标记法（Primed in situ labeling）应用 Klenow片段来进行特异DNA片段的定位分析。 1990年Hasse等报道了使用Taq酶的原位PCR 反应，将DNA扩增和原位分子杂交巧妙结合，至此直接使用生物细胞或组织进行目的基因的 PCR反应和原位杂交技术成熟。本试验利用 PCR方法直接从菌体中扩增和标记目的基因，是将引物介导的原位标记法和基因扩增过程合二为一。在PCR反应的94～95℃预变性2～5min 过程中菌体裂解，类似于煮沸法提取质粒的过程，使核酸物质释放成为扩增的模板，掺入含有非放射性标记的dNTP（DIG-11-dUTP碱不稳定型）经过25～30循环扩增出标记的目的基因。

（2）试验中发现挑取的菌量对PCR扩增的效果影响很大。菌细胞浓度＞10个/ml使破胞不完全，模板量不足，限制反应的进行，导致产量过低无法检测，更不利于产物的进一步纯化。菌细胞浓度＜10个/ml，模板量不足，扩增产量低。加入浓度约为10～10个/ml的菌细胞，在预变性过程中延长时间或升高温度以及使菌体处于单细胞是液状态都有助于破胞和充分反应。

（3）用PCR方法进行特异探针的标记必须是在保证扩增反应的特异性、忠实性、有效性的前提下完成，而这3个检验扩增效率的指标又是相互制约的，且均受反应中的众多成分和因素所影响。据此进行优化反应条件，为提高反应的特异性设计25～30个碱基的引物，GC含量接近 50%，将退火温度提高至65℃，在反应中加入 10%甘油以降低解链温度和链分解温度提高了退火引物的特异性。由于Taq酶不含核酸外切酶活性，在扩增中会以低而限定的速率产生错误，因此应用有3’→5’外切酶校正功能的pfu DNA聚合酶，减少扩增次数为25～30循环，使忠实性提高10～20倍左右，而进行目的基因鉴定时PCR反应的特异性和有效性更为重要，因此，使用Taq酶扩增即可得到良好的结果。由于地高辛标记的DNA合成速率只有未标记的DNA合成速率的一半，通常1000bpDNA在0.5～1min内可完全延伸，因此相应延长了标记反应的延伸时间为2min以提高产量。用于探针标记的PCR标准反应体系为50μl，总量太大影响标记的特异性和产量，试验发现20μl反应体系完全适用于目的基因鉴定。

此方法以单菌落为样品无须大量的其它环节在2～3h内即可准确鉴定出转化子，获得目的基因并完成标记，尤其适于基因工程中工程菌株很难提取的低拷贝数质粒或单拷贝数目的基因的操作，仅需少量模板DNA即可完成常规方法难以进行的低拷贝数的目的基因的快速鉴定与标记，与其它制备探针方法相比在检测低丰度、低拷贝数的目的片段时具有高灵敏度的优势，是一种具有精确、高效、稳定、实用特点的方法，使试验效率得到了大幅度的提高。

参考资料：中国生物工程杂志