DNA聚合酶I（DNA-pol I），分子量109kD，为单肽链组成，400分子数/细胞，是原核生物的DNA聚合酶，由于发现最早命名为DNA聚合酶I，其他原核生物的DNA聚合酶，按发现的先后顺序分别命名为DNA聚合酶Ⅱ、DNA聚合酶Ⅲ、DNA聚合酶Ⅳ和DNA聚合酶Ⅴ。

DNA聚合酶I的二级结构以螺旋为主，可划分为A至R共18个螺旋肽段。螺旋肽段之间由非螺旋结构连接。其中H区与I区之间的无规则结构较长，有50个氨基酸残基，I螺旋与O螺旋之间由较大的空隙，可以容纳DNA链，而50个氨基酸的无规结构，就像一个盖子那样与I、O螺旋区共同把DNA链包围起来，使其向一个方向滑动。DNA聚合酶I只能催化延长约20个核苷酸左右，说明它不是复制延长过程中起作用的酶。DNA聚合酶I在活细胞内的功能，主要是对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。

1、通过核苷酸聚合反应，使DNA链沿5’→3’方向延长（DNA聚合酶活性）

2、催化由3’端水解DNA链（3’→ 5’核酸外切酶活性，用于切除错配的碱基）

3、催化由5’端水解DNA链（5’→ 3’核酸外切酶活性，用于切除引物）

4、催化由3’端使DNA链发生焦磷酸解

5、催化无机焦磷酸盐与脱氧核糖核苷酸三磷酸之间的焦磷酸基的交换