高速逆流色谱法 (High-speed Countercurrent Chromatography，简称HSCCC)，于1982年由美国国立卫生院Ito博士研制开发的一种新型的、连续高效的液液分配色谱技术，与其它色谱技术不同的是它不需任何固态载体，因此能避免固相载体表面与样品发生反应而导致样品的污染、失活、变性和不可逆吸附等不良影响。同时它也具有适用范围广、快速、进样量大、费用低、回收率高等优点。因此，己在生物、医药、食品、材料、化妆品和环保等领域获得了广泛的应用，尤其是在天然产物活性成分的分离纯化领域倍受重视。

二十世纪六十年代，首先在日本，随后在美国国家医学研究院发现了一种有趣的现象：即互不相溶的两相溶剂在绕成螺旋形的小孔径管子里分段割据，并能实现两溶剂相之间的逆向对流。Ito及其后来者在此基础上研究并设计制造出了一系列逆流色谱装置，早期的是封闭型的螺旋管行星式离心分离仪CPC（coil planet centrifuge），用于分离染料，蛋白质和细胞粒子。数年后Ito把流通机制引入到螺旋管柱体系中，使逆流色谱和现代色谱一样可以实现连续的的洗脱、分离、检测和收集，并建立了两个基本的流通体制。其中有在比较简单的流体静力学平衡体制HDES基础上开发的作为分析分离的CCC、用作制备分离的DCCC以及移位腔室CCC等。另一方面，以流体动力学平衡体制HDES为基础，研制出在重力场作用下的大制备量分离仪器和在离心力场作用下的分析型和半制备型分离仪器。

1．高速逆流色谱技术的原理

高速逆流色谱法是建立在单向性流体动力平衡体系之上的一种逆流色谱分离方法，它是在研究旋转管的流体动力平衡时偶然发现的。当螺旋管在慢速转动时，螺旋管中的两相都从一端分布到另一端。用某一相作移动相从一端向另一端洗脱时，另一相在螺旋管里的保留值大约50%，但这一保留量会随着移动相流速的增大而减小，使分离效率降低。但使螺旋管的转速加快时，两相的分布发生变化。当转速达到临界范围时，两相就会沿螺旋管长度完全分开，其中一相全部占据首端的一段，我们称这一相为首端相，另一段全部占据尾端的一段，称为尾端相。高速逆流色谱正是利用了两相的这种单向性分布特征，在高的螺旋管转动速下，如果从尾端送入首端相，它将穿过尾端相而移向首端，同样，如果从首端相送入尾相，它将穿过首端相而移向螺旋管的尾端。分离时，在螺旋管内首先注入其中的一相(固定相)，然后从合适的一端泵入移动相，让它载着样品在螺旋管中无限次的分配。仪器转速越快，固定相保留越多，分离效果越好，且大大地提高了分离速度，故称高速逆流色谱。

2．高速逆流色谱色谱仪的基本配置

仪器的中心部分：(a) ITO多层线圈分离柱，它是由100-200米长、内径为1.6mm左右的聚四氟乙烯管沿具有适当内径的内轴共绕十多层而成，其管内总体积可达300mL左右。(b)平衡器，它可以调节重量，它的作用是让(a)， (b)相对于中心轴两边重量平衡。当在旋转控制器的控制下，在齿轮传动装置作用下，(a)，(b)同时绕中心轴作顺时针或反时针的行星运动，即(a)- (b)本身既在自转，但同时又在绕中心轴公转，公转转速可从0-4000r/min。从线圈分离柱中通过中空的中心轴还同时牵引出了线圈的两端，一端供泵入液用，一端输出液体。仪器工作需要互不相溶的两种液体，一相作固定相，一相作移动相。仪器工作前，先将作为固定相一相的液体通过恒流泵压入线圈分离柱，然后用进样器将待分离的样品进样，最后用恒流泵压入移动相，同时启动中心部分运转直到转速大于600r/min。此时，两相在线圈分离柱中具有相对运动之势。由于移动相源源不断的压入，阻止了固定相的流出，同时，移动相带着样品在线圈分离柱中进行无限次的分配而使复杂样品得到分离。当移动相经过检测器时，由于不同的样品组分会产生不同大小的信号，用记录仪就能得到逆流色谱图谱，同时用馏分收集器分步收集移动相就会得到复杂样品被分开的组分。较大的制备型HSCCC，柱容积可达530m1，一次最多进样可达20g粗品；较小的分析型的HSCCC柱容积为8m1，进样量为几十微克，最大转速可达4000r/min，分析能力堪与HPLC相媲美。

在常用的HSCCC基础上，有人提出“双向模式的高速逆流色谱” (dua-mode counter crurrent chromatography简称Dccc)，即前一次的流动相作下一次的固定相，洗脱方向相反。与常规的HSCCC相比，Dccc可以降低制备时间，免去柱冲洗时间，提高分离效率，不必预测溶质的保留时间和分配系数，减少了溶剂选择的繁琐。但由于溶剂体系系统不完善，应用范围较窄。

三、高速逆流色谱法的技术特点

1．应用范围广，适应性好

由于溶剂系统的组成及配比可以是无限多的，因而从理论上讲可以适用于任何极性范围内样品的分离，在分离天然化合物方面具有其独到之处。由于聚四氟乙烯管中的固定相为液体不需要固相载体，因而可以消除固-液色谱中由于使用固相载体而带来的吸附损失，特别适用于分离极性物质。

2．操作简便，容易掌握

仪器操作简单，对样品的预处理要求低，一般的粗提物即可进行的制备分离或分析。

3．回收率高

不需要固相载体，消除了由于样品在固相载体上的不可逆吸附和降解造成的损失，理论上样品的回收率可达。在实验中只要调整好分离条件，一般都有很高的回收率。

4．重现性好

如果样品不具有较强的表面活性作用，酸碱性也不强，即使多次进样，其分离过程都保持很稳定，而且重现性相当好。

5．分离效率高，分离量较大

由于其与一般的色谱分离方式不同，能实现梯度洗脱和反相洗脱，亦能进行重复进样，使其特别适用于制备性分离，产品纯度高，制备量大。

6．分配系数

溶剂系统的选择是同时选择色谱分离过程的两相，是对样品成功分离的关键所在，而样品中各组分的分配系数决定着这种溶剂系统是否合适，因此分配系数的测定是选择溶剂系统的重要环节。分配系数的测定多采用薄层色谱法、毛细管电泳法、HPLC法、生物活性分配比率法及分析型HSCCC法。

7、溶剂体系和溶液系统

高速逆流色谱常用基本溶剂体系表

上表中是根据被分离物质的极性列出一些基本的可供参考的溶剂体系，它包括非水体系和含水体系。

溶剂系统的选择对于HSCCC分离十分关键。遗憾的是目前为止溶剂系统的选择还没有充分的理论依据，而是根据实际积累的丰富经验来选择。通常来说，溶剂系统应该满足以下要求：溶剂系统不会造成样品的分解或变性样品中各组分在溶剂系统中有合适的分配系数，一般认为分配系数在0.2-5的范围内是较为合适的，并且各组分的分配系数值要有足够的差异，分离因子最好大于或等于1.5；溶剂系统不会干扰样品的检测；为了保证固定相的保留率不低于50%，溶剂系统的分层时间不超过30秒；上下两相的体积比合适，以免浪费溶剂；尽量采用挥发性溶剂，以方便后续处理尽量避免使用毒性大的溶剂。根据溶剂系统的极性，可以分为弱极性、中等极性和强极性三类。经典的溶剂系统有正己烷-甲醇-水、正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水、氯仿-甲醇-水和正丁醇-甲醇-水等。在实验中，应根据实际情况，总结分析并参照相关的专著及文献，从所需分离的物质的类别出发去寻找相似的分离实例，选择极性适合的溶剂系统，调节各种溶剂的相对比例，测定目标组分的分配系数，最终选择合适的溶剂系统。

四、高速逆流色谱法的应用

中国是世界上较早开展研究逆流色谱技术的国家，它的应用范围十分广泛，如生物工程、医药、天然产物化学、有机合成、环境分析、食品、地质、生物化学、医药学、农业、环境、材料、化工、海洋生物以及无机离子、保健品原料、食品添加剂和化妆品等众多领域。

1．天然产物

例如：用正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水(3：7：5：5)分离粉防己干根粗提物 ；正己烷/乙酸乙酯/乙醇/水(6：3：2：5)或正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水(1：1：I：I)体系分离红豆杉粗提物 ；分离紫杉醇混合物采用石油醚(40-60℃)/乙酸乙酯/甲醇/水(50：70：80：65)体系比较合适；采用正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水(3：7：5：5)有效分离肉桂酸、阿魏酸、咖啡酸混合物 ；采用正己烷/乙酸乙酯/甲醇/乙醇/水(5：7：5：1：1．5)五元体系分离紫杉醇和caphalornannine；氯仿/0.07 mol/L磷酸钠 0.04 mol/L柠檬酸缓冲液体系pH：

5.08，1：1分离制备马钱子碱和番术鳖碱 ；用氯仿/甲醇/丙酮 /水(5：6：1：4)分离挪威云杉针叶粗提物 ；用正庚烷/乙酸乙酯/甲醇/水(3：l0：IO：7)分离杂交番茄枝种子的粗提物 等等，一般均采用下相作流动相。

其它，尚有用正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水两步分离紫杉醇的同系物例(eaphalonmmaine，7-epi-10-deaeetyltaxo1)等 ，第一步采用(1：1：1：1)，第二步采用(3：3：2：3或4：4：3：4)并实现制备分离，并发现甲醇含量对分离效果影响较大；还有用多维高速逆流色谱(Multidimensional HSCCC)连续分离制备异鼠李亭、4，5，7-三羟基黄酮醇 槲皮苷，采用氯仿，甲醇/水(4：3：2)体系 J。总之，HSCCC分离制备天然产物是很适合的，不但适用于极性化合物，同样适用于非极性化合物；既可用于天然产物粗提物的去杂，也可用于最后产物的精制，甚至可一步得到纯品，当分析型的HSCCC的仪器转速达到2000r/rain以上，溶剂体系合适的情况下，分离速度可与HPLC相媲美。

中药来自于天然植物或动物，HSCCC同样可以应用于中药的单味药有效成分或方剂的有效部分的分离。例如采用正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水(1：1：1：1)和氯仿/甲醇/水(4：3：2)体系分离何首乌的氯仿提取物得到大黄素和蜈蚣苔素(physcioue)．分离其酒精提取物，得到1，2-二苯乙烯配糖物等。用乙酸乙酯/甲醇/水(50：1：50)分离何首乌干根的甲醇提取物，采用下相作流动相 ；用氯仿/甲醇/0.1 mol/L盐酸(4：1．5：2)分离制备黄连的生物碱，下相作流动相 ；用R134a/甲醇/水体系分离当归提取物，RliM-a作流动相，甲醇/水(65：30或70：30)作固定相；用氯仿/甲醇/水(4：3：2)分离银杏叶提取物得到4，5，7-三羟基黄酮醇，异鼠李亭，槲皮苷纯物质 。总之．HSCCC在中药方剂分离制备中尚属空白，因此开展HSCCC在这方面的工作有重要的意义。

2．抗生素

由于可以直接向HSCCC中进粗品，抗生素的分析和制备分离也采用HSCCC。进样量为1 mg一5 g。

一般可用疏水性体系分离抗生素。对于未知样品，强极性组分用含有正丁醇的体系，中等疏水性体系用含有氯仿的体系，疏水性用含有正己烷的体系 。例如：用氯仿/氯化乙烯/正己烷/甲醇/水(1：1：1：3 5：1)体系分离道诺红菌素衍生物 ．上相作流动相；用苯/氯仿，甲醇/水(15：15：23：7)分离依罗霉素( 娜in)混合物 ，进样量100mg，上相作流动相；用乙醚征己烷，甲醇/水(5：1：4：5)分离放线菌素(acting,vein)~合物 ，进样量达83 mg，上相作流动相；用氯仿/甲醇/水(4：4：3)体系分离杀念菌素(candicidin)衍生物 ．进样量100 mg，上相作流动相；四氯化碳/甲醇/0．01 mol/L磷酸钾缓冲液(pH=7)(2：3：2)分离尼达霉素(niddamycins)混合物 ．进样量100mg；用正己烷/L酸乙酯，甲醇/水(19：1：lO：lO)分离伊维菌素(ivermectin) ，进样量25 mg，下相作流动相；用氯仿/乙酸乙酯/甲醇/水(3：1：3：2)分离普那霉素(pristinamycins) 等等。

3．蛋白质和肽

用HSCCC分离制备蛋白或多肽的混合物最近的进展主要取决于以下3种因紊 ：采用低粘度的溶剂体系，溶剂体系大部分包含正丁醇；新型的pH区带提取逆流色谱的出现和发展；HSCCC与离子对逆流色谱的综合应用。后两种逆流色谱技术将在下面详述。例如：采用氯仿/苯/甲醇/水(15：15：23：7)分离短杆菌肽 ，进样量可达100 mg，上相作流动相；用氯仿/乙醇/水(5：4：3)或氯仿/乙醇/甲醇/水(5：3：3：4)分离杆菌肽(Baeitrlacin) ，进样量可达50mg；用正丁醇/O．03 mol/L三氟乙酸(1：1)分离黏菌素 ；采用正丁醇/二氯乙酸/0．1 mol/L甲酸铵(1：O．O1：0．01)、叔丁基甲基醚/乙腈/三氟乙酸(O．5% 一5%)(2：2：3)、叔丁基甲基醚/乙腈，三氟乙酸(1%)(2：2：3)或叔丁基甲基醚/正丁醇/乙腈/Z氟乙酸(1%)(2：2：1：5)等体系均可分离二肽混合物 ，进样量可达3∞ mg，下相作流动相；用正丁醇/0．2 mol/L甲酸铵(pH：8．5)(1：1，5o℃)或正丁醇/0．2mol/L甲酸铵(pH=9)(1：1)体系分离缩胆囊素。

4．食品

HSCCC应用于食品分离的最大优势是粗品或复杂样品可直接进样，一般用于食品除毒去杂或制备生物活性物质。例如用HSCCC检测食品中的毒素含量，分离SEA(导致食品污染的常见毒素)[28]；用正已烷/乙腈/叔丁基甲基醚(10∶10∶1)从香芹菜中分离falcarind和falcarindiel [29]；糖和PNP衍生物用HSCCC正交螺旋管行星式离心分离，溶剂体系是正丁醇/乙酸/水(4∶1∶5)或正丁醇/甲醇/水(4∶1∶4).分离体系通过衍生可以增加分子的疏水性，从而用HSCCC实现分离。

5．无机物

HSCCC在分离无机物方面的应用主要集中于稀土元素或重金属元素。例如用混溶的0.5mol/LDEPHA (二乙基已基磷酸盐)和十二烷作固定相，盐酸作流动相，富集稀有元素；用盐酸和氯仿(溶有0.15mol/L DEPHA)(1:1)溶剂体系分离镧系元素Sm、Gd、Tb、Dy、Er、Yb，效果良好；用EHPA(乙基已基磷酸盐)和单-2-乙基已基醚的甲苯溶液体系作固定相，含有镧系元家如钬和铒的溶液(相当于流动相)从上洗脱，在固定相中金属元素富集，并发现了稀有元素的复合物的保留值与流动相的pH有较大关系， pH升高，保留体积提高，但是理论塔板数下降，另外，在流动相中加入铵盐并不影响固定相保留值。根据上述方法，HSCCC可用于环境分析检测或控制污染。虽然灵敏度较低，但是固定相能够富集干扰的金属离子。

6．其它

随着技术的发展，HSCCC应用范围逐步拓展。已经有人尝试用HSCCC拆分消旋化合物。例如N-十二烷酰-L-脯氨酸-3，5-二甲基苯胺，成功地用于氨基酸的衍生物的分离。有人用HSCCC分离紫胶染料，溶剂体系是叔丁基甲基醚/正丁醇/乙醇/水(2∶2∶1∶5)，得到的物质纯度在95%左右。Ma和Ito发现增加有机固定相中手性选择性试剂的含量及增大溶剂系统的疏水性可提高色谱峰的分辨率。

五、高速逆流色谱法的前景

近年来，溶剂体系的选择范围越来越宽泛，有人提出用超临界二氧化碳做流动相，利用它的高扩散性、低粘度、流体特性及环境友好等其他溶剂不可比拟的优势分离化合物，还有人提出用制冷剂做流动相的可能性。还有人提出将三相溶剂体系用于高速逆流色谱分离中，可以对宽极性范围的样品进行很好的分离。三相溶剂还只用于标准品混合物的分离， 还没能用于具体天然产物的分离，相信进行进一步的发展在复杂天然产物以及药物的分离中有很大应用前景。

pH区带逆流色谱是一种最新发展起来的制备色谱技术，它能使样品的负载容量提高10倍以上，即使含量很低的物质也能得到高度浓缩。它是在固定相和流动相中加入一对试剂--保留剂和洗脱剂，保留剂用来把样品中的各组分保留在管柱内，当含有洗脱剂的流动相以一定流速穿过固定相时，由于酸碱反应最终达到平衡。以保留剂在两相中的浓度比标度分配系数保留剂的分配系数，溶质的分配系数与标度值的差异决定了溶质的出峰时间，根据不同组分的Pka和疏水性的不同而实现分离。其色谱峰呈逐一连接的高度浓缩的重叠很少的矩形峰状，很像替代色谱的色谱峰形。

离子对逆流色谱是在固定相中加入适当的配体，以提高溶质在固定相中的保留值，改进峰分离度，已广泛用于天然药物中肽类成分、生物碱与氨基酸等的分离。

双向逆流色谱（dual-mode countercurrent chromatography,简称DuCCC），即两相分别从螺旋管两端同时流入，又从相对应的端口同时流出，两相形成真正的逆向对流。与常规的HSCCC相比，DuCCC分离速度更快，分离效率更高，不必预测溶质的保留时间和分配系数，减少了溶剂选择的繁琐。该项技术可应用在蛋白分离。

HSCCC与质谱等其他技术的联用也是当前的研究热点，它把HSCCC分离的多样性与质谱的高灵敏度检测和结构分析特性良好地结合在一起，前景十分看好。为了克服HSCCC理论研究相对滞后的不足，有不少研究人员正从事理论研究，试图建立完善的理论基础来指导溶剂体系的选择，以期使HSCCC尽快从一种分离技术发展成为一门分离科学。

HSCCC一种独特的不用固态载体的液液分配色谱技术，是一种能实现连续有效分离的实用分离制备技术，能采用多种多样的溶剂系统对任何极性范围的样品进行分离，能实现从微克、微升量级的分析分离到上百毫克、数克量级的制备提纯，适用于未经严格处理的大量粗制样品的中间级分离，也能与质谱仪、红外光谱仪等分析仪器联用进行高纯度分析，应用前景十分广阔。