限制性核酸肉切酶(restriction endonuclease，RE)又称限制性酶、限制酶、限制性内切酶，是由细菌产生的能识别双链DNA中特定序列并水解该序列内部或一侧特定位点的磷酸二酯键的核酸内切酶。该特定序列称为限制位点。其研究历史最早可以追溯至20世纪50年代初期，到了20世纪60年代至70年代，由史密斯（Smith）、内森斯（Nathans）、阿尔伯(Werner Arber)三人共同推动限制性核酸内切酶的研究。

20世纪50年代初期，科学家们观察到X型菌株能选择性识别并抑制在其他Y型菌株中生长的噬菌体，这一现象首次揭示了细菌的宿主特异性限制现象。60年代末，研究证实大肠杆菌细胞内存在修饰-限制系统（modification-restriction system）。1968年，梅塞尔森（M.Meselson）和（R.Yuan）从E.coli K菌株中分离得到的第一种限制性核酸内切酶 EcoK，就是一种Ⅰ型限制性核酸内切酶。1970年，史密斯（Smith）等人从流感嗜血杆菌中成功分离出第一种Ⅱ型限制性内切酶，并实现了DNA的特异性切割。次年，内森斯（Nathans）研究团队利用该酶对猴病毒SV40 DNA进行切割分析，开创性地绘制出首个DNA限制性图谱，这一突破性工作为基因分离和基因图谱构建奠定了基础。1973年，史密斯和内森斯共同提出了一套限制性核酸内切酶的命名方法，并被广大学者所接受并一直沿用至今。鉴于限制性内切酶在分子生物学研究中的革命性贡献，阿尔伯(Werner Arber)、内森斯和史密斯共同荣获了1978年诺贝尔生理学或医学奖。之后限制性核酸内切酶与连接酶等一起共同推动了基因工程的深入发展。

限制性内切酶的命名遵循一套标准化的科学命名规则：首字母取自产生该酶的细菌属名的首字母（大写），第2-3个字母取自细菌种名的前两个字母（小写），第4个字母（可选）表示特定菌株（如EcoRⅠ中的R代表RY13菌株），最后用罗马数字标明该菌株中分离到的酶的发现顺序编号（如Ⅰ表示第一个被发现的酶）。按照国际惯例，命名时前三个字母需采用斜体书写，罗马数字则用正体。典型示例包括EcoRⅠ（源自大肠杆菌Escherichia coli RY13菌株的第一个限制酶）和HindⅢ（源自流感嗜血杆菌Haemophilus influenzae Rd菌株的第三个限制酶）。

限制性核酸内切酶在微生物界分布广泛，其存在呈现显著的物种差异性和丰度多态性。几乎所有细菌的属、种都编码至少一种限制性内切酶，其中嗜血杆菌属（Haemophilus）尤为突出，目前已鉴定出22种不同的限制酶。不同菌株间的酶表达水平存在数量级差异：某些菌株如大肠杆菌E. coli pMB4(产生EcoRⅠ酶)和埃及嗜血杆菌H. aegyptius（产生Hal Ⅲ酶）能够高水平表达限制酶，后者甚至可制备足以消化10克λ噬菌体DNA的酶量；而多数菌株仅微量表达，难以分离纯化。细菌是限制性内切酶，尤其是特异性非常强的Ⅰ 类限制性内切酶的主要来源。

根据酶结构、作用及与DNA结合和裂解的特异性，将限制酶分为3型。

三聚体结构，多酶复合体，具有限制性内切酶和DNA修饰酶活性，这种酶通常在识别位点下游1kbp范围内切割DNA，切割位点不确定。

单体酶，绝大多数只有限制性内切酶活性，是基因工程中剪切DNA 分子的常用工具酶。可在DNA分子内部的特异位点识别和切割双链DNA，其切割位点的序列可知、固定。通常所说的限制内切酶就是指这一类酶。

二聚体结构，多酶复合体，具有限制性内切酶和DNA修饰酶活性，能在识别位点附近切割DNA，切割位点很难预测。在基因克隆中，Ⅰ型和Ⅲ型酶都没有多大的实用价值。

Ⅰ型和Ⅲ型限制性核酸内切酶作为多亚基蛋白复合物，兼具内切酶和甲基化酶双重活性，其功能特性显著区别于Ⅱ型限制酶。Ⅰ型限制性核酸内切酶的正常活性不仅需要Mg2+作为必需辅因子，还依赖ATP提供能量和SAM（S-腺苷甲硫氨酸）作为甲基供体。以EcoB和EcoK为代表的I型限制酶由三个功能亚基组成：特异性亚基负责识别特定DNA序列（如EcoK的AAC(N)6GTGC二重识别序列）、修饰亚基具有甲基化活性、限制亚基行使内切酶功能。这些酶的活性严格受DNA甲基化状态调控：当识别序列双链完全甲基化时，ATP促使酶从DNA解离；半甲基化状态（单链甲基化）下ATP激活另一条链的甲基化；仅当识别位点完全未甲基化时，I型限制酶才表现出切割活性。Ⅰ型限制性核酸内切酶展现出独特的DNA切割机制：当酶结合到特定的识别位点后，会以滚环式转位的方式沿DNA分子移动，这一过程需要ATP水解提供能量支持。在完成转位后，酶会从识别位点5'端数千碱基对外的随机位置切断DNA分子。

现已知的Ⅲ型限制性核酸内切酶数量很少。EcoP1结构为由M亚基（负责特异性识别与甲基化修饰）和R亚基（具有核酸内切酶活性）组成的异源二聚体复合物。这类酶的活性严格依赖于Mg2+、ATP和SAM（S-腺苷甲硫氨酸）等辅助因子的存在。与Ⅰ型限制酶类似，III型酶也表现出独特的切割机制：在识别特定非对称序列后，酶复合物可沿DNA分子移动，最终在距离识别位点约25bp的位置进行单链切割。然而，不同于I型酶的长距离随机切割，III型酶的切割位点相对固定。

II型限制性核酸内切酶具有独特的结构和功能特征，与I型和III型酶形成鲜明对比。这类酶由单一多肽链组成，通常以同源二聚体形式发挥功能，其核心特性表现为：首先，能够精确识别双链DNA的特异序列并在特定位点进行切割；其次，切割产生的两个单链断裂位点通常呈交错分布而非完全对称；最终，这种交错切割产生具有互补单链黏性末端的DNA片段。这种特异性切割机制为DNA重组技术提供了关键工具，特别是产生的黏性末端极大便利了不同DNA片段的重组连接。

Ⅱ型限制性核酸内切酶的识别序列通常为4-8个核苷酸组成的特定DNA片段，这些具有回文结构的序列（如连续型的GATC或间断型的GANTC）既是酶的识别位点也是切割位点。这类序列的特征在于其双旋转对称性——当以中心轴对折时，两条单链能形成互补配对，这种结构特性使得限制酶能以同源二聚体形式对称结合DNA，并在识别序列内部的特定位点进行切割，最终产生具有互补末端的DNA片段（黏性末端或平末端）。回文结构的识别机制不仅确保了双链DNA被精确切割，也为后续的DNA片段连接重组提供了结构基础。

异源同工酶（isoschizomers）是指来源不同但能识别和切割相同DNA序列的限制酶，如BstE Ⅱ和BamHⅠ都能识别G ↓ GATCC序列并在相同位点切割，产生相同的黏性末端。这类酶在实验中可以互为替代，为分子克隆提供灵活性。

同尾酶（isocaudamers）则是指识别序列不同但能产生相同黏性末端的限制酶，如BamHⅠ（识别G ↓ GATCC）和Sau3AⅠ（识别N ↓ GATCN）。它们产生的末端称为配伍末端（compatible end），这些末端可以相互连接，但连接后的重组序列将不再被原酶识别。

限制性核酸内切酶的消化效率高度依赖于DNA样品的纯度，常见污染物如蛋白质、有机溶剂（酚/氯仿/乙醇）、EDTA、SDS及高浓度盐离子等均会显著抑制酶活性。针对纯度不足的DNA样品，可采取四种优化方案：增加酶用量至10单位/μg DNA以上、扩大反应体积稀释抑制剂、延长37℃孵育时间至过夜、或添加预热后的亚精胺（终浓度1-2.5mmol/L）以促进基因组DNA消化。

甲基化酶广泛存在于真核生物和原核生物中，在原核生物中作为限制-修饰系统的重要组成部分，通过甲基化修饰保护宿主DNA免受自身限制性核酸内切酶的切割。当识别序列中的特定核苷酸发生甲基化时，会显著抑制限制酶的活性，这也是从常规大肠杆菌宿主中分离的质粒DNA常出现局部消化或完全抗切割现象的原因。为解决这一问题，基因克隆中通常采用甲基化酶缺陷型大肠杆菌菌株来制备质粒DNA。限制酶对甲基化核苷酸序列的切割抑制特性在分子操作中具有重要应用价值：当甲基化酶识别序列与某些限制酶识别位点相邻时，可改变限制酶的切割特异性；在DNA片段末端修饰实验中，可通过甲基化保护内部的限制酶识别位点，确保衔接物的精确酶切。

不同限制性核酸内切酶具有各自特定的最适反应温度。虽然大多数限制酶的标准反应温度为37℃，但存在显著例外：SmaⅠ的最适温度为25℃，ApaⅠ为30℃，MaeⅠ为45℃，而BstE Ⅱ 等高温酶甚至需要60℃以上环境才能发挥最佳活性。温度对酶活性的影响极为敏感，偏离最适温度会导致酶活性显著下降甚至完全失活。例如，TaqⅠ酶在37℃时活性仅为65℃最适温度下的10%；同样，ApoⅠ在37℃条件下的活性也仅有其在50℃最适温度时的一半。

DNA分子的构象差异会显著影响限制性核酸内切酶的切割效率。研究表明，部分限制酶消化超螺旋质粒DNA或病毒DNA所需的酶量较线性DNA高出数倍，极端情况下可达20倍。这种差异主要源于超螺旋DNA的空间位阻效应和拓扑张力对酶-DNA复合物形成的影响。此外，某些限制酶对同一DNA底物中不同位置的识别位点表现出切割效率差异，这种现象称为位点偏好性（site preference）。其分子机制可能涉及DNA局部构象的细微差异影响酶的结合亲和力、位点周围序列特征对酶活性的调节以及DNA高级结构对特定位点的可及性限制。

限制性核酸内切酶的标准缓冲液体系包含多个关键组分，各组分具有特定的功能：Mg2+（通常以MgCl2形式提供）作为必需辅因子维持酶活性；Tris-HCl缓冲体系（pH7.4）确保最适反应条件；巯基试剂（β-巯基乙醇或DTT）通过维持酶蛋白的还原状态来稳定部分限制酶活性，但同时可能稳定潜在杂质；BSA（工作浓度100μg/mL）则通过防止酶蛋白表面吸附来维持低浓度酶溶液的稳定性。根据不同限制性核酸内切酶对离子强度需求差异，限制酶缓冲液可分为三种类型：高盐型（100mmol/L NaCl）、中盐型（50mmol/L NaCl）和低盐型（无NaCl）。

单酶切是指用一种限制性核酸内切酶切割DNA样品,这是DNA片段化最常用的方法。如果DNA样品是环状DNA分子,产生的DNA片段数与识别位点数(n)相同,并且DNA片段的两个末端是相同的。如果样品是线状DNA分子,产生的DNA片段数为1,其中有两个片段的一端仍保留原来的末端。

双酶切是指用两种不同的限制性核酸内切酶切割同一种DNA分子,从而产生的DNA 分子片段带有两个不同的末端,这是实验操作中常用的手段之一。如果载体分子也用同样的两种酶切割,那么可以把外源DNA酶切片段定向地插人载体分子中,实现基因重组。使用两种酶同时进行DNA切割反应时,为了节省反应时间,通常希望在同一反应体系内进行同步酶切,这时要求酶的反应缓冲液和反应温度是相同的。商品化的限制性核酸肉切酶有很多是在儿种缓冲液中都具有很高的内切酶活性,因此,在实际操作中,可以选择使所用的两种限制性核酸肉切酶都具有活性的缓冲液或通用缓冲液来进行酶切反应。在很多情况下,两种限制性核酸内切酶的反应条件不一样,这就需要分步酶切。

部分酶切是指选用的限制性核酸内切酶对其在DNA分子上的全部识别序列进行不完全切割,酶切只发生在部分位点。部分酶切通常是在构建基因文库或者需要酶切基因组后,为获得一定大小范围内的片段而使用的酶切方法。在实验中可以通过缩短酶切消化的反应时间或降低反应温度以约束酶的活性而达到部分酶切的目的。

限制性内切酶除作为基因工程剪切DNA的工具外，广泛应用于分子生物学研究的各个领域内，包括探针制备、DNA杂交、限制性酶切图谱分析、DNA指纹分析、基因组 DNA 文库构建、DNA 测序、DNA 同源性比较等。

DNA重组：藉助限制性核酸内切酶切割目的DNA和载体，在连接酶帮助下两个DNA连接成为重组DNA。

构建新质粒：新质粒构建是基因重组中的重要手段，离开限制性核酸内切酶的消化，就无法构建新质粒。

组建DNA物理图谱：构建DNA物理酶图谱，必须使用限制性核酸内切酶在双酶消化或不完全消化条件下进行。

DNA分子杂交：DNA分子杂交时，必须使用限制性内切酶消化制备受体DNA片段，才能进行杂交。

制备DNA放射性探针：使用限制性内切酶,将标记大片段切割成小片段，作放射性探针。

DNA序列分析：利用限制性核酸内切酶切割大片段DNA成小片段，便于序列分析。