1554年（天文23年），
斋藤道三将家督之位和稻叶山城交由长子
斋藤义龙继承，退往鹭山城隠居，但是他较偏爱次男孙四郎及三男喜平次，据传他已产生废除义龙的想法，因此斋藤义龙先下手为强，和重臣长井道利串谋对付道三，在
1555年（弘治元年）10月时诈病骗来孙四郎及喜平次两名弟弟，派遣家臣日根野弘就暗杀两人，由于斋藤义龙已获西美浓三人众等美浓豪族支持，组织起17,500大军，而道三方仅有2,700人，局势对道三方明显不利。
斋藤道三获知此事后，越过长良川进入大桑城和斋藤义龙对峙，待到来年春季冬雪消融后，义龙方在4月18日再度对大桑城发起攻势，南边的
尾张国大名
织田信长因为是斋藤道三的女婿也发兵北上驰援道三，而斋藤道三自知城池不足防守，在20日下至长良川一带。
混战中，由斋藤义龙任命的先锋竹腰道尘率先发动突击，直接切入道三本阵，斋藤道三凭借巧妙的指挥击退竹腰的部队，杀死竹腰道尘，但斋藤义龙随即亲率旗本队渡河巩固阵形，兵力较少的道三方渐趋不利，终究被斋藤义龙击溃，斋藤义龙部将长井忠左卫门、小真木源太杀死斋藤道三，而来援的
织田信长也在获报后撤回尾张。
斋藤道三死后，斋藤义龙以出家来表示对弑父的赎罪，法名“饭贺”。而道三之死也象征和尾张织田家的盟约告终，为南下进攻
尾张国，斋藤义龙先后联合
织田信广、
织田信安，意图对抗织田信长却都失败。但在美浓国内政方面，斋藤义龙重新以
贯高制稳定领内家臣的知行，导入宿老合议制，以安藤手就、
氏家卜全、日根野弘就、竹腰直光、日比野清実、长井卫安六人辅政，深植斋藤家统治美浓的基石。
道三死后，织田信长也主张道三死亡时有遗言该由自己继承美浓，成为信长后来攻打美浓国的口实，和斋藤义龙、龙兴两代交战（稻叶山城之战），并且获得原来道三一派的斋藤家臣如猪子高就、斋藤长龙投靠。