一些内切酶如Hae 皿和Hpa I切割产生的DNA 片段没有黏性末端，而是平端(bluntend,也叫钝端)。具有平端的酶切载体只能与平端的目的基因连接。T4 DNA 连接酶可催化相同和不同限制性核酸内切酶切割的平端之间的连接。

原则上讲，四大组中的C小组所含限制性内切酶，只DNA切割末端附近的结构不妨碍连接，均可构成一大族平端的配伍末端，可彼此互相连接。这种连接的应用范围很广。平端连接比黏性末端连接要困难得多，其连接效常常增加DNA的率很低，只有黏性末端连接效率的1%，故在平端DNA片段连接工作中，浓度，同时用数倍于黏性末端连接的连接酶处理，以期获得比较满意的连接结果。这种连接常出现多联体连接。