载体两性电解质是一些具有相近等电点的分子量为600－900Da的多氨基多羟基两性化合物的混合物。它在大于其等电点的pH环境中解离成带负电荷的阴离子，向电场的正极泳动，在小于其等电点的pH环境中解离成带正电荷的阳离子，向电场的负极泳动。这种泳动只有在等于其等电点的pH环境中，即蛋白质所带的净电荷为零时才能停止。

载体两性电解质等电聚焦电泳的基本原理是利用蛋白质分子或其他两性分子等电点的不同，在一个稳定、连续的线性的pH梯度中进行蛋白质的分离和分析电泳检测方法。

在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶中加入载体两性电解质(CarrierAmpholytes)，通以直流电后即可形成从阳极到阴极、pH由低到高(即环境由酸变碱)逐步增加的连续而稳定pH梯度。当蛋白质分子在pH梯度中迁移时，将获得或失去质子从而携带不同数目的电荷。当pH>pI时，蛋白质带负电荷，在电场的作用下向正极移动；当pH净电荷为零，在电场的作用下不发生移动。随着其净电荷和流动性的降低，蛋白质在电场中移动的速度也将放缓。随着时间的延续，蛋白质会从系统中的任何地方迁移至其稳态即等电点位置，在该位置，蛋白质将不带电并停止迁移。

如果已经到达等电点位置的蛋白质扩散到pH值较低的区域，那么它仍将会被质子化，并在电场的作用下向阴极迁移。相反，如果它扩散到高于其等电点的pH区域，蛋白质将带负电荷，并会向阳极驱动。这样一来，具有不同等电点的蛋白质最终都聚焦在各自的等电点pH处，并形成一个个清晰的区带。这种“浓缩”或称“聚焦”效应使等电聚焦的分辨率大大高于常规电泳。

两性电解质的选择

载体两性电解质是等电聚焦电泳中最关键的试剂，它直接关系到pH梯度的形成以及蛋白区带的聚焦。载体两性电解质的常用浓度为2%～2.5%，2%用于2mm厚的凝胶，2.5%用于0.5 mm厚的凝胶，3%用于超薄胶。pH梯度范围的选择取决于被分析的蛋白质的等电点。对于未知的样品通常先用宽的pH范围来找出欲测蛋白质pI的位置，然后再用合适的窄pH范围更好地分辨这些谱带并准确的测定其等电点。使用窄范围的载体两性电解质可以提高分辨率并增加载样量。

凝胶的配制和灌胶

介质的选择 在等电聚焦中大多采用聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶作为稳定介质，它们各有优缺点。聚丙烯酰胺凝胶由于它的高分辨率，不仅能分离含有各种生物大分子物质的混合物，而且可以研究生物大分子的特性，诸如电荷、分子质量、等电点甚至构象等，是实验室最常用的支持介质。

聚丙烯酰胺溶液的配制 通常丙烯酰胺单体储备液浓度为30%凝胶单体贮液，T(总浓度)和C(交联度)分别为30%和3%，临用前稀释至所需的浓度。浓度选择根据所需分离的样品大小，一般为5%～8%，不能低于3%亦不能高于12%。否则胶浓度过低则凝胶过软不易操作，且影响分辨率；浓度过高则胶的孔径太小不利于样品的自由迁移。

制胶常用制胶法有盖板法、毛细管法和平移法。其中毛细管灌胶法模具简单，且凝胶厚度、大小可由自己掌握，在实验室中较常用。平移法采用Ultromould模具灌胶，最为方便，适用于工业生产中的大批量样品检测，但凝胶大小和厚度受模具的限制。一般来讲，凝胶的厚度越薄，其分辨率越高，蛋白条带越清晰锐利。

电极液的选择 聚丙烯酰胺等电聚焦电泳的电极液应根据两性电解质的pH梯度范围选择。

等电聚焦电泳及电泳后的检测

由于pH值具有温度依赖性以及防止烧胶，一般采用商品化的冷却系统或将电泳仪和电泳槽置于冷柜中进行电泳。在等电聚焦电泳中，通常采用恒功率方式。在等电聚焦过程中，随着样品的迁移，电流会越来越小，为了使样品中的组分更好地分离应不断的加高电压，高电压可以减少形成pH梯度和蛋白分离所需的时间。但过高的电压可能会使样品变性和影响pH梯度的稳定性，甚至烧胶。等电聚焦的时间取决于凝胶的pH范围，样品的迁移率和电泳时的电参数。一般在窄pH范围所需的电泳时间比宽pH范围长。这是因为在窄范围pH环境时蛋白已经接近它的等电点，带电少，故迁移慢，也就需要更长的聚焦时间。等电聚焦电泳的步骤一般分为预聚焦、点样、样品分离和条带锐化等几个步骤。

蛋白质在完成等电聚焦电泳后经固定、染色以及脱色等步骤后即可检测其等电点，常用的有等电点标准扫描定位法和pH梯度曲线作图法。其原理均是根据蛋白在pH梯度迁移率的不同而计算得来，可根据各自实验室的情况进行选择。

载体两性电解质等电聚焦电泳具有很多优点，如分辨率高、能抵消扩散作用而使区带越走越窄、聚焦浓缩稀样品、重复性好、精确度高等。但其也存在不足之处，如对样品的纯度要求较高；要求样品成分在等电点时稳定，不适宜用于在等电点时不溶解或变性的蛋白质。

因为调节蛋白质的等电点(pI)简便易行，具有实用价值，是许多科研工作者首选的方法之一。蛋白质等电点掌握准确的程度，直接关系到最终生产药物的质量和科研工作的成败。所以，测定出真实、准确的蛋白质等电点(pI)是科研工作达到预期的目的和生产工艺付诸实施的重要前提，是保证产品质量、完善生产工艺的重要因素。

自等电聚焦电泳技术开始应用于蛋白的理化性质研究以来，尚无其他技术可以完全取代。已有商业化的IEF凝胶出售，部分IEF过程如灌制、染色等已经程序化。但人们渴望得到的等电聚焦电泳应该是分辨率能不断提高，能够分离极端酸性、极端碱性、难溶、大分子量蛋白，操作过程趋于简化，最好能全面的自动化，对蛋白质的定量定性分析更灵敏、快速、准确、经济实用。相信在不远的将来等电聚焦电泳技术会日臻完善并满足上述要求，在蛋白质理化性质研究尤其是重组蛋白药物的工艺建立以及质量研究等方面发挥更大的作用。