以二氧化碳作为主要或唯 一的碳源，以无机氮化物作为氮源，通过细菌光合作用或化能合成作用获得能量的微生物。

硫细菌 靠吸收H2S并将其氧化放能

铁细菌 将2价铁氧化成3价铁放能 　硝化细菌 氧化亚硝酸盐

高中常见的化能自养一般就这几个学习从合成氨厂周围土壤或通气良好的耕地土壤中采样、富集培养、分离纯化硝化细菌。

学习硅胶平板制备，了解培养硝化细菌的培养基制备和培养方法。

化能自养微生物由于它们在农业生产、能源开发、冶金、采矿等方面的实际应用及在产能代谢、分子遗传等理论研究方面的重要性，日益受到人们重视，本次实验以硝化细菌为代表，介绍化能自养微生物的分离与纯化。

硝化细菌是化能自养菌类群中主要生理类群之一。包括亚硝化细菌和硝化细菌(或称亚硝酸氧化细菌)两个亚群。它们是需氧菌、利用无机物氧化过程获得能量同化CO2，合成细胞物质。

除在土壤氮素养分转化及自然界氮素循环起重要作用外，由硝化细菌组装的亚硝酸微生物传感器，可快速检测大气和水中的亚硝酸浓度，在环境监测中发挥作用。培养硝化菌的温度，因菌源而异，从中温环境下分离的菌株，最适生长温度为26—28℃，从高温环境中分离的菌株，40℃时生长良好，该菌喜中性或微碱性环境，倾向于团体表面上生长，在液体培养基中培养时，往往附着在培养液中碳酸钙颗粒上，沉淀于瓶底，或沾附在瓶壁上，影响细菌的分散和分离。若采用硅胶平板自富集培养液中分离硝化细菌时，滴加菌悬液于平板前要用CO2通气处理(防止菌沾附瓶壁、沉淀瓶底或吸附在碳酸钙颗粒上)。

化能自养菌代时长，生长极其缓慢，而伴生的异养菌却生长迅速，为使欲分离的生长劣势化能自养菌转化为生长优势菌，均需经专门培养该菌的待定培养液中使之富集培养，并限制其他菌繁殖，然后从富集培养液中分离、纯化。为避免异养菌或其他生理特性相似的自养菌污染，纯化后的菌株，尚需进行纯度检查和菌种的鉴别。

(一) 菌源

合成氨车间周围和堆放合成氨场地周围土样。

(二)培养基

硝化细菌分离培养基、硝化细菌增殖培养基、检查有否异养型微生物的培养基(肉膏蛋白胨酵母膏培养基(BPY)，麦芽汁培养基、马铃薯葡萄糖培养基)，参见附录二。

(三)试剂

格里斯氏试剂(亚硝酸盐试剂)、二苯胺硫酸试剂(硝酸盐试剂)。

(四)其他物品

稀释分离所用的无菌水、无菌培养皿、无菌移液管、无菌微口滴管、无菌玻璃涂棒等。

(一)采样

按实验6—1采集土样，选合成氨车间和堆放合成氨场地周围土样。

(二)富集培养

称取土样1g。接入到盛有20 m1硝化细菌增殖培养液的250 ml锥形瓶中，28℃振荡培养10-14d，每隔几天在白瓷板上分别加2—3滴格里斯氏试剂及二苯胺硫酸试剂。然后用无菌滴管取出1滴增殖培养液的培养物加于上面两试剂中．搅和均匀。检查增殖培养液中NO2-的减少(溶液由红色、粉红色变为无色，机理见实验7—3)和NO3-的形成(NO3-氧化二苯胺的特有反应，溶液由无色变为深蓝色)。为淘汰伴生的异养细菌，富集培养10 d后，用无菌微口滴管吸取1—2滴富集培养物接入新鲜的硝化细菌增殖培养液中，继续振荡培养，继续监测NO2-的减少和NO3-的形成，在连续转移的后期增殖培养液中．可通过不断补加KNO2，增加硝化细菌数日，并有效地抑制伴生的异养型细菌生长。

(三)分离纯化

取富集培养液，通CO2气体30min，然后静置30 min 。再通过下列三种方法分离纯化。

1．硅胶平板分离法

(1)制取硅胶平板 取等体积的盐酸(HC1比重1．09)和硅酸钠(比重1．10)溶液，徐徐加入，缓慢混合，均匀搅拌，分装于100-00 m1透析袋中．水中透析48h，其间换蒸馏水6—8次，待透析袋内的硅酸纳溶液无色透明后，高压蒸汽灭菌或过滤除菌。灌浇硅胶平板时，注意无菌操作技术，分别吸取预先配制并灭好菌的硝化细菌分离培养基1m1,酸钠溶液10ml于无菌培养皿内，静置片刻，待凝固后即可使用。

(2)硅胶平板分离 采用涂布分离法。取0.1—0.2m1富集培养液滴于5—10个硝化细菌分离培养基硅胶平板上，涂布分离。然后将硅胶平板放在盛有少量水的干燥器里(防止水分蒸发，避免硅胶平板干裂)，于28℃恒温下培养3—4月，当硅胶平板上出现硝化细菌极小的菌落后(多数菌落小于100μm)，挑取10-20个单菌落，分别接种到硝化细菌增殖培养液中，28℃恒温下培养3—4周，依前述方法检验NO2-及NO3-。

2．稀释法

按稀释分离方法取富集培养液稀释至10-4、10-3、10-6三个稀释度，分别用无菌滴管于上述稀释液中吸取培养物1—2滴接种10-20瓶硝化细菌增殖培养液中，28℃恒温箱中培养3周后，依前述方法检验NO2-的减少和NO3-的增长。

3．微口滴管滴分法

此法依据是接种的每小滴培养液中尽量只含有一个硝化细菌的细胞。分离时，用无菌的微口滴管吸取少量富集培养液的上清液接种于盛有硝化细菌增殖培养液的锥形瓶中(接种时倾斜锥形瓶，使瓶底露出培养液的液面，以微口滴管尖端轻轻接触锥形瓶底即可)，共滴10-20瓶，28℃恒温培养3—4周，按前述方法检测NO2-及NO3-的消长。

三种分离纯化方法中稀释法简便易行，分离效果较好；硅胶平板分离法可直接获得纯种。

(四)纯度检查

由于硝化细菌培养过程，常会有异养型细菌伴生，所以必须用多种有机营养培养基检查培养物是否有异养型细菌污染。常用的有机营养培养基是：BPY培养基检查异养型细菌，麦芽汁培养基检查酵母菌，马铃薯葡萄糖培养基检查霉菌。上述培养基平板或斜面接种培养物后若有菌生长，表明分离瓶中培养物不纯；不生长，则为基本纯的培养物。若有异养型微生物存在，需重新分离、纯化。

(五)镜检

对分离纯化的硝化细菌进行镜检及革兰氏染色。常见的硝化细菌特征见表6-2-l所示。

表6-1-2 常见的硝化细菌

属

细胞形态

鞭毛

革兰氏

染色结果

硝化杆菌属

短杆状有时呈梨形或球形

单鞭毛，通常不运动

G-

硝化球菌属

球形

偏端鞭毛，运动

G-

硝化刺菌属

细长直杆状，老培养物中为球形

不运动

G-