米氏常数（Km）的含义是酶促反应达最大速度（Vm）一半时的底物(S)的浓度。它是酶的一个特征性物理量，其大小与酶的性质有关。它被广泛应用到生物化学、分子生物学、基因工程、生物制药、临床用药等领域的理论、实验和实践中。
一、概述
在20世纪初期，就已经发现了酶被其底物所饱和的现象，而这种现象在非酶促反应中，则是不存在的，后来发现底物浓度的改变，对酶反应速度的影响较为复杂，1913年前后Michaelis和Menten作了大量的定量研究，积累了足够的实验证据，从酶被底物饱和的现象出发，按照中间产物设想，提出了酶促反应动力学的基本原理，并归纳为一个数学表达式，称之为米氏方程式：
[E]+[S]↔[ES]↔P+[E]
v=Vm[s]/(Km+[s])=Vm/(1+Km/[s])
式中，[E]为游离酶浓度；[S]为底物浓度；[ES]为酶与底物结合的中间络合物浓度；v为酶促反应速度；Vm为酶促反应最大速度；Km为米氏常数，是酶促反应达最大速度（Vm）一半时的底物(S)的浓度
二、Km的含义
Km的含义是酶促反应达最大速度（Vm）一半时的底物(S)的浓度。，即当V=Vm/2时，【S】=Km,单位为mol/l。Km是酶极为重要的动力学参数，其物理含义是指ES复合物的消失速度常数（k-1+k2）与形成速度常数（k1）之比。
三、Km的求法
Km即是当反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。从v—[s]矩形双曲线上可得V，再从V/2处可求得Km值，但实际上，即使用很大的底物浓度，也只能得到趋近于V的反应速度，而达不到真正的V，因此测不到准确的Km值，为了得到准确的Km值，可以把米氏方程式加以改变，使之成为斜截式：y=kx+b的直线方程，然后用图解法求出Km值。
1.LineweaverBurk方程（双倒数作图法）
1/V=Km+[S]/Vmax[S]改写成1/V=Km/Vmax[S]+1/Vmax
实验时选择不同的[S]测定相应的v，求出两者的倒数，以1/v对1/[S]绘出工作曲线如下图，然后利用斜率，换算出Km。
实际上，由于操作条件和操作技能所限，以及操作时准确度达不倒要求，引入误差太大等原因，常常得不到这样的一条理想的直线，那么它的斜率就不是一个定值，因而Km的值就不能直接由这种作图法求出，或求出的Km值不准确。如果令1/v=0，则1/[S]的截距为-1/Km，然后根据具体的数值，换算出Km。但这需要在实验操作的同时要进行相关的推导和计算，并且是在明确1/[S]的截距与Km关系的前提之下。
2.Hanes作图法
[S]/V=1/Vmax[S]+Km/Vmax
上式也是直线方程式，称为Hanes方程式。用[S]/V对[S]作图，所得直线的斜率为1/Vmax，[S]/V轴上的截距为Km/Vmax，而[S]轴上的截距为-Km。Hanes法的优点为数据点在坐标图中的分布较平坦，但因[S]/V包含两个变数，这就增大了误差，且统计处理也复杂得多。
四、Km的意义与应用
米氏常数在酶学和代谢研究中均为重要特征数据。
（1）同一种酶如果有几种底物，就有几个Km，其中尾值最小的底物一般称为该酶的最适底物或天然底物。不同的底物有不同的Km值，这说明同一种酶对不同底物的亲和力不同。一般用1/Km近似地表示酶对底物亲和力的大小，1/Km愈大，表示酶对该底物的亲和力愈大，酶促反应易于进行。
（2）已知某个酶的Km，可计算出在某一底物浓度时，某反应速度相当于Vmax的百分率。
（3）在测定酶活性时，如果要使得测得的初速度基本上接近Vmax值，而过量的底物又不至于抑制酶活性时，一般[S]值需为Km值的10倍以上。
（4）催化可逆反应的酶，对正逆两向底物的Km往往是不同的。测定这些Km值的差别以及细胞内正逆两向底物的浓度，可以大致推测该酶催化正逆两向反应的效率，这对了解酶在细胞内的主要催化方向及生理功能有重要意义。
（5）当一系列不同的酶催化一个代谢过程的连锁反应时，如能确定各种酶的Km及其相应底物的浓度，还有助于寻找代谢过程的限速步骤。
（6）了解酶的Km值及其底物在细胞内的浓度，可以推知该酶在细胞内是否受到底物浓度的调节。如酶的Km远低于细胞内的底物浓度(低10倍以上)，说明该酶经常处于底物饱和状态，底物浓度的稍许变化不会引起反应速度有意义的改变。反之，如酶的Km大于底物浓度，则反应的速度对底物浓度的变化就十分敏感。
（7）测定不同抑制剂对某个酶Km及Vmax的影响，可以区别该抑制剂是竞争性还是非竞争性抑制剂。
五、Km的影响因素
Km值随测定的底物种类、反应的温度、pH及离子强度而改变。