DNApolⅠ的这种活性可以催化3'末端焦磷酸解
DNA分子。这种作用就是无机焦磷酸分解DNA生长链，可以认为是DNA聚合作用的逆反应，而且这种水解DNA链作用需要有
模板DNA的存在。(dNMP)n+XPPi←(dNMP)n-x+X(dNPPP)→DNA
最后两种作用，都要求有较高浓度的PPi，因此，在体内由于没有足够高的
PPi而无重要意义。
DNApolⅠ的DNA聚合酶活性和5'→3'外切
酶活性协同作用，可以使DNA链上的切口向前推进，即没有新的DNA合成，只有核苷酸的交换。这种反应叫
缺口平移(Nicktranslation)。当双链DNA上某个
磷酸二酯键断裂产生切口时，DNApoIⅠ能从切口开始合成新的NDA链，同时切除原来的旧链。这样，从切口开始合成了一条与被取代的旧链完全相同的新链。如果新掺入的
脱氧核苷酸三磷酸为α-32P-dNTP，则重新合成的新链即为带有同位素标记的
DNA分子，可以用作探针进行分子杂交实验。
尽管DNApolⅠ是第一个被鉴定的
DNA聚合酶，但它不是在
肠杆菌中DNA复制的主要聚合酶。主要证据如下：[1]纯化的DNApolⅠ催化
dNTP掺入的速率为667碱基/分，而体内DNA合成速率要比此高二倍数量级;[2]
大肠杆菌的一个
突变株中，此酶的活力正常，但染色体
DNA复制不正常;[3]而在另一些突变株中，DNApolⅠ的活力中只是野生型的1%，但是DNA复制却正常，而且此
突变株增加了对
紫外线、
烷化剂等突变因素的敏感性。这表明该酶与DNA复制关系不大，而在DNA修复中起着重要的作用。