游离脂肪酸含量是指原料经粉碎等处理后，用索氏抽提器等技术用无水乙醚等做溶剂提取油脂，提取的油脂经不同方法的测定得到的浸出油中油酸的质量百分含量即为游离脂肪酸含量。最常见的测定游离脂肪酸含量的方法是采用滴定法测定。

将样品溶解在混合试剂中，用标准的氢氧化钾溶液滴定存在的游离脂肪酸。

乙醚；

95%乙醇；

0.1mol/L氢氧化钾标准溶液：按GB/T601制备标定。

中性混合试剂：乙醚+95%乙醇，1+1（V+V）

指示剂：1%酚酞乙醇溶液

参照表1称取试样注入锥形瓶中，加入中和的混合溶剂100mL，加入酚酞指示剂0.5mL，用0.1mol/L氢氧化钾溶液滴定至粉红色（持续30sec）。

式中：V——所用标准氢氧化钾溶液的体积，mL；

C——所用标准氢氧化钾溶液的浓度，mol/L

56.1——氢氧化钾摩尔质量，g/mol

m——试样的质量，g

Antaris II FT-NIR 型光谱仪，配TQ Analyst 8,、Result Integrantion 和Result Operation软件

酚酞-乙醇溶液：10g/L

中性混合试剂：乙醚95%（体积分数）乙醇体积1:1组成的混合溶液。

样品台温控模块温度设定为60℃， 60选择透射扫描模式，扫描波数4000-12000cm-1，扫描次数为32次,分辨率为8cm-1。

采集光谱前仪器预热1h。采用滴管移取少量样品于样品管中， 将样品管插入样品台中的杯架中。先进行参比（空气）扫描，参比扫描结束后，再扫描样品。采用TQ Analyst8软件进行数椐处理，以偏最小二乘（PLS）回归算法建立模型，将样品分为校正集和验证集。采用校正集样品建立校正模型并采用验证集样品进行验证，最后根据校准决定系数、内部交叉验证决定系数、预测决定系数、验证均方差（RMSEC）、交叉验证标准差（RMSECV）及预测标准差（RMSEP）等指标确定最优校正模型。

取样品，于100mL 离心管中，加入二氯甲烷－甲醇溶液( V/V = 2∶1)，0.0001g，然后匀浆、4000r /min 条件下离心5min; 取出离心管后，分别取下层溶液和上层溶液于具塞试管中，加入20%的0.88% KCl 溶液后混匀，过夜分层后取下层液体真空干燥，所得物质即为粗脂肪。当得到总脂肪后，加入酮－甲醇溶液( v /v = 2∶1) 和Amberlyst－A26 阴离子交换树脂于恒温振荡器中震荡2h 后去除溶液，用丙酮－甲醇溶液洗5 次( 共用20mL) ，最后在通风橱中用氮气将交换树脂吹干后待甲酯化。

在圆底回流瓶中加入提取的油脂或吸附后的树脂并加5mL 0.5mol /L 的氢氧化钠甲醇溶液混匀后连接回流装置。在100℃水浴中加热回流5min，然后加3mL 三氟化硼－ 10% 甲醇溶液反应5min，最后加入2mL 正己烷回流萃取2min，取出冷凝装置将回流瓶冷却至室温后加NaCl 饱和溶液混合，并将其移入具塞试管中，反复冲洗回流瓶3 次将洗液一并倒入具塞试管中静置。待分层后吸取上层溶液( 正己烷层) 约lmL 于样品瓶中，于4℃下保存，以备气相色谱仪分析。

气相毛细管柱为Agilent SP－2560，100m × 0.25mm i.d × 0.2μm，柱初始温度60℃，以8℃ /min 升温至180℃，1.5℃ /min 升温至240℃，保持3min; 气化室温度250℃; 载气: N2; 柱流速:1mL /min; 分流比: 30∶1; 进样量1μL。

结果采用与标准品对照法定性及内标定量，并以平均值± 标准偏差( mean ± SD) ( n = 5) 的形式表示。数据采用SPSS 16.0 统计分析软件进行数据分析，利用方差分析( One－Way ANOVA) 检验数值间的差异显著性，当p < 0.05 时视为具有显著性差异。

油脂水解产物中游离脂肪酸的检测主要利用气相色谱法, 但预处理步骤较为繁琐, 需要通过改变水解产物pH 值或利用薄层色谱预先将游离脂肪酸分离。柱前衍生HPLC 法测定游离脂肪酸不需要分离游离脂肪酸的前处理, 且HPLC 检测分离温度较低, 脂肪酸热降解程度大大降低, 具有气相色谱法无可比拟的优越性而得到了广泛的应用。利用柱前衍生HPLC 法测脂肪水解产物中游离脂肪酸的研究国外已有论文发表。

Agilent -1100 型高效液相色谱、Zorbax SB -C18柱:美国安捷伦科技有限公司。

洗脱程序:初始流动相∶乙腈∶水(5∶95)经15 min梯度洗脱变化至100 %乙腈, 继续洗脱17 min ;体积流量1 .6 m L/min ;柱温:25 ℃;检测波长254 nm ;进样量20 μL , 利用外标法进行定量分析。

准确称取等量的2 , 4 -二溴苯乙酮和18 -冠-6醚配制成一定浓度的衍生化溶液, 置于4 ℃条件下避光保存;分别称取肉豆蔻酸、硬脂酸、油酸和亚油酸0 .164 、0 .333 、0 .772 、0 .286 g , 以甲醇和二氯甲烷1∶1(v∶v)混合溶液定容至100 mL 待用。取上述脂肪酸标准溶液0 .15 mL 于具塞反应管中, 加入相应浓度的衍生化试剂3 mL , 另加入0 .4 g 碳酸钾已形成pH值为8 .3 ～ 8 .5 的缓冲体系。混合物于80 ℃水浴中加热30 min , 反应液置于4 ℃条件下冷却1 h , 过0 .45 μm滤膜后, 待HPLC 分析。准确样品0 .15 g , 以甲醇和二氯甲烷1∶1(v∶v)混合溶液定容至10 mL, 加入1 g 无水硫酸

钠脱去酶解物中的水, 4 200 r/min 离心5 min , 取上清液0 .15 mL , 按上述中脂肪酸标准品衍生化步骤处理, 所得样品待HPLC 分析。

选用OriginPro 7 .5 软件(OriginLab Corporation ,Northampton , USA)对数据进行单边方差分析(ANOVA)。显著性分析采用LSD 检验, 显著性水平采用0.05 。