IUPAC 对旋转异构体的定义是“由于绕
单键旋转受阻碍而不能轻易互相转换的一组
构象异构体”。绕单键旋转受阻碍，通常是由于旋转的基团与别的基团之间有排斥力，导致转动过程中分子
势能升高。当能垒足够高的时候，构象异构体之间就不能轻易互相转换，而是可以被分离。这种构象异构体就被称为旋转异构体。
在有机物分子中，当连接在某一
单键上的几个基团在围绕该单键旋转时，它们相对于同一分子中其它基团的空间位置就发生了变化，这样就形成了不同的
构象。
可以看出，在最中间的 C-C 键 （正丁烷有三个 C-C 键）一端的两个氢原子和一个
甲基在围绕该 C-C 键转动时，形成了无数个不同的构象，每个构象都有自己的势能。随着转动角度的变化，势能起伏变化，呈现出几个极小值。具有极小值势能的几个构象互为
构象异构体。
当一个构象异构体转变为另一个构象异构体时，需要越过一个
能垒，也就是上图中势能的“峰”。当能垒很高的时候，两个构象异构体不能轻易互相转换，这种情况中的两个构象异构体就互为旋转异构体了。 能垒有多高才能使构象异构体被称为旋转异构体，这个并没有严格的定义，只是在你的实验条件下，如果一个构象异构体能够在足够长的时间内保持自己的构象，可以和其它构象异构体分离，它就可以被称为旋转异构体。在日常使用中，有些科学家会把构象异构体和旋转异构体这两个词混用，这当然是违背这两个词的标准定义的。
上图所示是同一化合物的三种构象异构体。两个甲基和一个
苯甲基在围绕 C-C 键旋转时，会因与 -COOCH3 之间的排斥力导致这三个构象具有势能极小值。这个化合物
色谱图显示出两个峰。对这两个峰做 H-
NMR 分析，发现其中一个峰是第一个构象异构体，另一个峰是后两种构象异构体的混合物。也就是说，第一个构象异构体与后两种构象异构体之间有足够大的能垒，使它能够被分离出来，因此第一个构象异构体与另两个构象异构体互为旋转异构体。
上图所示是 R,S-
酒石酸的三种构象异构体。在色谱图中，R,S-酒石酸呈现出两个峰。对这两个峰进行 X 射线衍射、H-NMR 和 C-NMR 分析后，发现一个峰是构象异构体 1，另一个峰是构象异构体 2 和 3 的混合物。这表明，
构象异构体 1 是可以被分离出来的，它和 2、3 互为旋转异构体。