道光十七年拔贡，授兵部七品小京官，迁主事，充军机章京。二十三年，举顺天乡试，再迁郎中。 咸丰十年，擢鸿胪寺少卿。时江南大营溃，总督
何桂清弃常州，苏、常相继陷。毓瑛疏陈军事，略曰：“拯溺救焚，其事宜急而不宜缓。捣虚批亢，其事宜合而不宜分。臣前读
都兴阿奏，拟自英山由豫境绕赴徐、宿，以达江北，而
曾国藩通筹方略，拟分三路进剿，俟八月大举。窃谓都兴阿由豫境以达江北，程途纡远，非两月不能到。浙江自萧翰庆阵亡，江长贵自平望退守，锐气尽消。以屡溃之孱兵，御剽悍之勍贼，待至八月，松、太、杭、嘉、湖诸郡势将瓦解，蔓延愈广，规复愈难。为今计者，都兴阿宜自英、霍取道临、凤以抵江北，不过旬日，即由通、泰渡江，直抵江阴，进攻常州、无锡为一路，而以周沐润所募沙勇副之；镇江现有兵万馀，巴栋阿、
冯子材、
向奎进规丹阳为一路；
薛焕在上海增募勇丁万人，由嘉定、太仓、昆山进攻苏州为一路，而命
张玉良出嘉兴、平望以副之；
曾国藩率楚师由宁国取道广德，进抵嘉、湖为一路，策应诸军，而令米兴朝攻宜兴、溧阳，周天受攻高淳、东坝，
曾秉忠督长龙船入太湖以副之。攻贼之所必救，据贼之所必争。俟曾国藩新募勇至，然后分路进剿，庶於事有济。”
英、法两国合兵犯京师，上幸热河，军书旁午，枢臣未全从，上命择章京资深才优者佐诸大臣办事。毓瑛在直久，诸大臣欲举以应，固辞，遂越次用
焦祐瀛。十一年，穆宗即位，诸大臣皆谴罢，乃命毓瑛在军机大臣上学习行走，迁顺天府丞。同治元年，迁大理寺卿，授军机大臣。二年，擢
工部侍郎，调兵部。三年，江南平，加头品顶戴，赐花翎，署
兵部尚书。四年，擢左都御史，寻授兵部尚书。五年，卒，赠太子少保，谥恭悫。
方
端华、
肃顺擅政，毓瑛独不附。及佐枢政，廉慎勿懈，每谓：“军旅大事，患在信任不专，事权不一。古来良将，率以掣肘不能成功。”时以为名言云。
曹毓瑛，字琢如，生于嘉庆十八年江阴大司马街大司马坊下的一个建自明崇祯末年的古老宅第里。他的祖父曹学礼，字翼庭，父亲曹昶字映宸，乾隆年就居住于此。按清御史陈荣绍为他所撰墓志铭记载，他26岁已由拔贡在军机处任七品京官，道光二十三年朝廷旨曹毓瑛补军机
章京，自此一直在军机处十余年。
当时清室以郑亲王端华、
怡亲王载垣为内阁，国内外不靖，咸丰欲以军机章京中资深才赡者主持军机，他认为曹毓瑛在军机处时间较长，内娴掌故外悉四方，有意举曹主持军机。而曹毓瑛托故坚辞。同僚都很奇怪。由此可见，曹对当时朝内权臣与内宫的矛盾早有觉察。咸丰死后，以郑怡二亲王和协办大学士肃顺为首的
顾命八大臣与二宫之间矛盾更趋尖锐。肃顺多次对曹威胁利诱，曹毓瑛以前朝老臣而忠于皇室正统，对肃顺等虽有不满却不敢表露，只得婉言谢绝并托词回乡省亲。其随从长班赵和提醒他应知已获杀身之祸，不如先发制人。
曹遂冒生命危险化妆成内监密入内宫，向二宫揭露肃顺等在军机密议图谋，并奏请立即回銮。慈禧即与恭亲王（咸丰六弟）筹划对策，在回銮途中拿下郑怡二亲王及肃顺。肃顺被斩首至菜市口。后郑怡二亲王亦被赐饮毒酒自尽，这就是清历史上的“
祺祥政变”。政变后建立了以二宫太后为中心、以恭亲王为摄政并以文祥（满人）、曹毓瑛（汉人）为军机大臣并兼顺天府丞的统治（相当于京城市长）。同治元年正月转大理寺少卿兼宗人府丞，后升大理寺卿；同治三年兼吏部侍郎；同治四年，权兵部尚书。据史料记载，曹毓瑛于同治五年三月二十日因劳成疾寝疾六日而殁，享年54岁。死后，清皇室赐银二千两治丧，并派员护灵回籍，安葬于江阴定山。
关于曹毓瑛的传说也很多。有传说他与慈禧关系暧昧，在深宫被同治撞见，曹回府第后即舔鹤顶自尽（一品大员在朝珠下面有一颗红的珠子，系鹤头顶首制成，剧毒）；有传说他辞官后在常州自尽等。此说法毫无根据，纯属无稽。因为当时有一些臣民因恨慈禧垂帘丧权辱国，而曹毓瑛又是慈禧的宠臣，所以自然对曹毓瑛有一种片面的看法，再加上清廷丧权辱国的一些条约的签订均在此之间，但此时曹毓瑛已去世多年。据台湾作家高阳根据清史和故宫的一些资料而写成的小说《
玉座珠帘》内对曹毓瑛在清咸丰同治期间的各项活动，可以看出曹毓瑛其人其事和其才能。此虽为小说，但他确实在慈禧和肃顺等八大顾命大臣之间夺权斗争中为维护清宫正统起了很大作用，因而受到慈禧的恩宠。在当时政治背景中，他不屈服于肃顺的威胁利诱而以三朝老臣忠于清室，辅保二宫，他的保守和正统思想比较典型。
“
祺祥政变”之后，文祥奉旨查抄肃顺府第，在肃顺府第内的一个保险箱内发现大批达官们给肃顺的秘密信件。其中很多是支持肃顺密谋的权贵。这批重要的密件被送至军机处曹毓瑛手中，如按清律将牵连的不下数百人之多。曹向恭亲王建议皇上冲龄，垂帘尚未实行，不宜大批殊杀朝臣，不如秘而不宣，付之一炬。恭亲王对曹毓瑛向来视如左右手臂，对曹言听计从，当即同意销毁，这样一来，免遭株连的内外官员达百余人之多。
同治三年，曹毓瑛省亲后回京，太后
慈禧召见，询及江阴风景如何。曹奏江阴滨临长江之口，环山临水，风景秀丽，有十大名山。太后问有哪十大名山，曹毓瑛即口占一诗：“君黄龙凤长，稷定桂（谐音龟）花香”，有歌颂皇室取悦太后之意。太后大喜。曹当即奏山民贫苦，能请朝廷下悯，太后准免除江阴山民税赋，为家乡江阴做了一件好事。
曹毓瑛自道光进京为官至同治五年去世，历位三朝，由七品小京官至军机章京起直至兵部尚书一品的大吏及清廷赐以紫禁城骑马太子少保等最高荣誉，不可不谓显赫一时。但是他为官清廉，他没有在京城或家乡购田置产建造府第。虽然他的几个儿子也都在外做官，但都很清贫，身后囊空如洗。他的故居依然是他祖父曹氏十四世的曹学礼堂所置的一座明末古建（大司马坊下的曹氏宅第保留移建了一进，即现曹颖甫故居）。民国以来，他的子孙后代大都以教书为业。