插入型载体一般只含有一个限制性位点可供插入外源DNA 的载体，其DNA 已经失去了非必需区，仅保留了ECOR I的单一切点，而且这个切点又位于报告基因上，故在切开DNA并插入外源基因后，报告基因失活，即可依此进行重组体的筛选。

插入型载体可插入长度为10kb的外源DNA。属于这类载体有λgt系列。λgt10在失去了非必需区的DNA的CI基因内保留Hind皿和ECORI单酶切位点，在当有外源DNA在这酶切位点插入时，使CI基因失活，感染hfI-大肠杆菌后可形成空斑。λgtll是在噬菌体DNA插入的lacZ基因末端设有单一的ECORI酶切位点。在此处插入外源基因，可表达B-半乳糖苷酶的融合蛋白，利用异性抗体或DNA测序方法可筛选重组DNA。这类载体适宜构建CDNA文库。