细胞能够从周围环境中摄取
DNA分子,并且不易被细胞内的
限制性核酸内切酶分解时所处的一种特殊生理状态称感受态(competence)。自然环境中细菌可以吸收外源遗传物质以增加自身对环境的适应性。人工感受态的形成, 需要低温和钙处理,这样可能破坏了细胞膜上的脂质阵列 ,Ca2 +与膜上的多聚羟基丁酸化合物、多聚无机磷酸形成复合物利于外源DNA 的渗入, 外部理化因素促进了感受态的形成。
受体细胞经过一些特殊方法(如:CaCl2,RuCl等化学试剂法)的处理后,细胞膜的
通透性发生变化,成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的
感受态细胞。
例如野生型
大肠杆菌并不容易转化,这是由于DNA无法进入野生型大肠杆菌的细胞。经过多年的努力,科学家们发现了一种方法可以增加细胞吸收外源DNA的效率。那就是用化学方法处理细胞,使其改变膜对DNA的通透性。这种细胞就称为感受态细胞,即细胞处于能摄入核酸分子时的生理状态。这种方法已经成为基因工程的常规技术,它对于我们利用体外
DNA重组技术来了解真核和
原核生物的基因功能特别重要。细菌的感受态有两种类型:一种是自然感受态(Natural competence),自然感受态细菌可以自由地吸收DNA,通过它来进行
遗传转化;另一种是人工感受态(Artificial competence),在这种转化中,细菌发生改变使得它们能摄入外源DNA。
枯草芽孢杆菌属于能够发展为自然感受态的细胞,大肠杆菌就属于需要人工处理的细胞。
感受态细菌细胞的转化采用氯化钙的方法。不含有质粒的
大肠杆菌菌株在室温下使其解冻并加入40mL S.O.C 的
液体培养基。在37 ℃培养1h , 然后将其转移到37 ℃摇床上以200r /min 速度培养2 ~3h, 直到OD600 达到0.2 ~ 0.4。不同细菌菌株的最适宜OD600 是不同的。在4 ℃下以8000r /min 的速度离心1min, 然后用一半体积(20 mL)已灭菌的预冷的TB(CaCl2)溶液进行悬浮, 并在冰上保存25 min。如上进行另一次离心后,所得到的细胞沉淀用十分之一体积(4mL)预冷的TB (CaCl2)溶液进行悬浮获得感受态细胞。感受态细胞可于4 ℃下保存3d。
转移1.6 mL的感受态细胞悬浮液至已消过毒的冷藏管内,并加入已灭菌的0.4 mL甘油使最终浓度达到20%,混匀。甘油储液可在- 4 ℃,- 20 ℃和- 70 ℃下分别储存待用。