差异显示
克隆技术
是利用一系列的oligo(dT)引物,逆转录真核生物细胞中全部表达的mRNA,通过PCR扩增的方法,转换成cDNA双链,再利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,将有差异的片段分开,筛选出目的基因。
技术发展
1992年,梁朋和Pardee首次提出差异显示技术(DD-PCR),并且利用这一技术克隆了几个基因。由于该技术具有快速、灵敏、简单和可分析低丰度mRNA的优点,很快成为克隆新基因和研究植物基因表达的有力工具。这项技术最初用于医学研究上,近年来已开始在高等植物研究中应用,为研究高等植物的发育、生理代谢、基因表达提供了重要的技术手段。
技术步骤
从植物组织中提取总RNA
在这个步骤中注意不能有DNA污染,一般用无RNA酶DNA酶在37℃下处理30min
以Oligo T11MN为引物(M为G、A、C中的任一种,N为A、C、G、T任一种),进行逆转录
扩增cDNA的第一条链
使差异表达的cDNA片段在6%测序胶上分开
从胶上切割下来,并回收,再进行第二次扩增;
差异片段
差异片段可作为探针;
验证目的片段,去掉假阳性片段;
基因组文库中筛选出相应的全长基因。
技术优势
差异显示技术由于充分利用PCR技术和反转录,因此比较快速,且利用该技术能够观察细胞中mRNA的组成,了解植物不同发育阶段或不同环境条件下的细胞之间的差异表达,克隆目的基因。
应用领域
研究激素对植物发育的影响
研究植物发育过程
研究抗病机制
研究次生代谢途径
研究抗冷机理
参考资料
参考资料.四川大学生命科学学院.
最新修订时间:2022-11-26 20:18
目录
概述
技术发展
技术步骤
参考资料