培养基灌装是指在无菌生产工艺验证中，以培养基替代实际生产介质，模拟实际产品灌装过程，以检验无菌生产线能否达到无菌保证水平。

新建成的无菌生产线只有连续三次成功地通过培养基灌装后，才能投入生产使用。

无菌生产工艺是制药领域难度最大的工艺之一。由于许多药品无法最终灭菌, 它们在进行配制、灌装等暴露作业时就必须尽可能避免被微生物污染。而影响产品是否无菌的因素相当多, 诸如生产区的设计及其设备布局、生产时的环境状况、所有与生产相关的设备及物料的污染状况、人员操作和卫生状况等, 每一个环节对最终产品的质量都举足轻重。为了确保无菌生产工艺系统无菌的可靠性和适应性, 需通过一定的验证方法来对其进行验证。多数厂家采用培养基灌装试验来证明其无菌工艺的可靠性。2010版GMP附录1《无菌药品》第四十七条明确规定：“培养基灌装容器的数量应当足以保证评价的有效性。批量较小的产品，培养基灌装的数量应当至少等于产品的批量。培养基模拟灌装试验的目标是零污染，应当遵循以下要求：

（一）灌装数量少于5 0 0 0支时，不得检出污染品。

（二）灌装数量在5 0 0 0至10000支时：

1 .有1 支污染，需调查，可考虑重复试验；

2 .有2 支污染，需调查后，进行再验证。

（三）灌装数量超过10000支时：

1 .有1 支污染，需调查；

2 .有2 支污染，需调查后，进行再验证。

（四）发生任何微生物污染时，均应当进行调查。”

首先, 所有的相关设备及其工艺均应事先通过确认或验证, 如洁净生产区环境须通过静态验证(空气的悬浮粒子、浮游菌、沉降菌及表面微生物均应符合相应的规定) , 操作人员的卫生及其操作行为均须经过严格的培训, 生产主要设备(如灌装机、冻干机等) 以及与生产相关的其它辅助工艺(如淋洗、湿热灭菌、干热灭菌去热源、除菌过滤等) , 均须通过确认或验证。

2. 1　培养基的选择

为了尽可能地检出无菌生产工艺系统中可能会给实际产品造成污染的微生物, 所选用的培养基应尽可能适应广谱微生物的生长, 包括细菌、霉菌和酵母菌等。验证试验前, 可用下述方法来鉴别验证用培养基的可行性。首先严格按照培养基生产商的要求进行配制和灭菌, 然后将无菌培养基分装至一定数量的无菌小瓶或试管内。同时, 制备好三种微生物[ 枯草芽孢杆菌(B acillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(S tap hy lococcus au reus) 和白色念珠菌(Cand id a a l2bicans) ]的悬浮液, 菌液浓度控制为100～ 1000 个菌/ml。

将上述准备好的无菌培养基分成三等份, 且每份至少两瓶(支) , 分别加入上述菌悬液各0.1 m l。将接有枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的培养基于30～ 35℃下培养, 接有白色念珠菌的培养基于20～25℃下培养。如果在7 d 内, 每种微生物培养基均至少有50% 长菌, 则认为该培养基可用于无菌工艺验证试验。实践证明, 营养肉汤培养基或大豆胰蛋白胨液体培养基( soybean2casein digest medium ) 均适用于培养基灌装试验。

2. 2　培养基灌装试验的频率

新建的或生产工艺进行过重大更改后的无菌工艺生产线, 必须经至少连续三批合格的培养基灌装试验后方可证明被验证工艺的可靠性。常规生产条件下的再验证频率, 每年至少两次,每次至少灌装一批。由于不同时间的气候状态不同, 务必考虑对实际生产操作的每个班次进行培养基灌装试验。如果因培养基灌装试验不合格而重新灌装时, 灌装时间(班次) 要与初始灌装的时间(班次) 相同。

2. 3　灌装体积和灌装数量

一般来说, 每只容器的灌装体积不得少于其容积的三分之一 , 这样才能保证有足够数量的培养基与容器的内表面充分接触并且易于观察到微生物的生长状况。确定培养基的灌装数量时须考虑以下两个主要因素。一是应符合统计学要求, 即在95% 的置信限至少能检出千分之一的污染率; 二是被验证工艺的日常实际生产批量。因为实际生产批量与无菌工艺操作所持续的时间和灌装速度密切相关, 而培养基灌装的持续时间应足以涵盖实际生产条件下的全部操作, 并且培养基的灌装数量应能反映出在等于或小于实际生产的灌装速度下产品及容器所暴露时间“最差状况”。因此, 当某无菌生产线的实际生产批量大于5000 瓶时, 则培养基的灌装批量不得少于5000 瓶,当无菌生产线的实际生产批量最多不超过5000 瓶时, 则按日常最大批量灌装即可。

2. 4　无菌培养基的制备

对于产品溶液与培养基溶液配制方法相似的无菌生产线来说, 用培养基替代产品组分完全模拟实际生产时的配液操作进行培养基配制(按培养基生产商的要求)、除菌过滤、并将除菌后的培养基溶液接入一无菌接收罐。对于那些产品溶液配制方法与培养基溶液配制方法不同或是生产粉针剂的无菌生产线来说, 可按照下述方法配制无菌培养基。在洁净区内, 将事先称量好的培养基加入一无菌的洁净配制罐内, 按照培养基生产商的要求配制培养基溶液。在无菌环境下,用无菌管路将配制罐通过一已灭过菌的装有0. 22μm滤膜(或滤芯) 的过滤器与一无菌的储罐(储罐顶部的通气口应配有0. 2 μm 的疏水性过滤器) 连接起来, 通过加压或减压将培养基溶液经除菌过滤后转移至无菌储罐内。过滤结束后, 检查除菌过滤器的完好性, 如果检查结果合格, 则无菌培养基制备完成。

2. 5　无菌灌封

模拟实际灌装作业进行培养基灌装。灌装容器及胶塞应尽可能与常规生产时一致。灌装时, 最好能模拟实际生产时的最差状况, 如设备维修、操作人员的更换等, 以掌握在实际生产条件下产品污染的真实资料。对粉针剂生产线而言, 为了验证实际生产状态下的粉末灌装, 可用适当的无菌粉末模拟灌装, 再向瓶内注入无菌培养基。用于验证试验的粉末要求流动性好、易溶于培养基并且没有抑菌作用, 如乳糖或甘露醇等; 粉末灭菌可采用辐射灭菌法或环氧乙烷灭菌法; 灌装时, 每瓶内的粉末量不宜过多, 否则会对培养基溶液的促菌生长造成不良影响, 实践证明,每5 m l 液体培养基内乳糖含量不宜超过0. 3 g。对水针剂而言, 灌装培养基后可直接压塞。对冻干剂而言, 灌装后, 只进行半压塞, 模拟实际操作将半压塞瓶转移至冻干机内。培养基的冷冻温度不得低于3℃, 因为温度过低会使一些微生物死亡或受到损伤, 造成污染水平降低的假象, 就不能如实反映无菌工艺的实际无菌水平。模拟冻干时, 适当进行部分真空和充氮保护模拟(请注意, 真空度不宜过高,否则会引起培养基暴沸; 充氮过量会抑制需氧性微生物的生长)。冻干结束后, 在腔室内全压塞, 然后卸出并转移至压盖间压盖。将压完盖的培养基上下颠倒几次以使培养基与胶塞及整个容器内壁充分接触。从压塞至最终的培养检查, 应将盛装培养基瓶的托盘容器做好标记, 以便对所出现的偏差进行追溯。

2. 6　培养和计数

将压好盖的培养基先置于20-25℃培养至少7天，然后在30！35继续培养7天。培养期间, 可定期对灌装培养基进行目检, 记下每次检出的污染瓶数及出现污染菌的相应托盘编号。检查时将每瓶培养基在有白色光源的黑色背景下仔细目测。透明、澄清、无混浊的培养基判为无微生物生长; 如培养基混浊或有悬浮的菌丝或菌落, 则需作进一步的微生物生长检查, 以确定培养基是否真正染菌。对已确定有微生物生长的培养基瓶进行仔细检查, 看其中是否有破损, 有破损的培养基瓶不得纳入最终的结果评价。每批灌装培养基的污染率可按下式计算:

污染率% = 污染的培养基瓶数×100/(灌装总瓶数- 破损瓶数)

2. 7　污染菌的鉴别

将培养基瓶中的污染菌在适当的培养基(如大豆胰蛋白胨琼脂、营养琼脂等) 上划线和分离培养。挑取单个菌落进行形态学观察、革兰氏染色等初步鉴别。如果需要对培养基灌装结果作进一步调查, 那么将污染菌鉴别到种, 这对偏差调查将起到非常关键的作用。寻找污染菌与其它资料(如环境监控资料) 间的相关性是无菌工艺偏差调查的有效手段。

2. 8　培养基灵敏度检查

从每批灌装好的培养基中随机抽取适量培养基, 按照中国药典(或美国药典) 无菌检查法中的培养基灵敏度检查法, 分别向培养基中接入下列试验菌悬液, 每个菌株至少接种两瓶灌装培养基, 每瓶接种量为10～ 100 个菌。

表1　培养基灵敏度试验用微生物

1可用枯草芽孢杆菌(B acillus subtilis)A TCC 6633 替代;

2可用铜绿假单胞菌(P seud om onas aerug inosa)A TCC 9027 替代。

将接有上述微生物的培养基置于相应温度下培养, 每种菌株在7 d 内应至少有一瓶出现明显生长,否则可复试一次。如果灵敏度检查结果不合格, 该批培养基灌装试验无效, 须重新试验。

2. 9　环境控制

无菌生产区的环境确认和验证是无菌生产工艺验证的前提条件。而培养基灌装时的环境监控资料对整个工艺验证的评价和偏差分析将起到非常关键性的作用。培养基灌装时的环境监控项目及取样数量均不得少于常规生产时的监控项目和取样数量。将日常的环境监控资料汇总, 并与培养基灌装时的环境监控资料以及培养基灌装结果相结合进行趋势分析, 不仅能对企业所执行的清洁、消毒方案以及人员卫生规范作出客观评估, 而且可以为合理制定适合于本企业内部的环境控制标准(警戒标准和纠偏标准) 提供依据。

2. 10　合格标准和污染概率

培养基灌装结果的评价是无菌生产工艺验证中的一个焦点。由于对合格标准的理解存在差异, 同一个数据往往会导致不同的结论。美国药典(U SP 24)对无菌药品的污染率作如下规定:

最终灭菌药品的无菌保证水平(SAL ) 不得低于10- 6, 即污染率不得超过百万分之一;

无菌灌装药品的无菌保证水平(SAL ) 不得低于10- 3, 即污染率不得超过千分之一。

实践证明, 对设计合理并且生产操作环境得到良好控制的无菌生产线而言, 其产品污染率维持在千分之一以内并不难。企业须通过培养基灌装试验来证明其无菌生产线所生产的无菌产品的污染概率始终维持在这一水平下。值得注意的是, 验证结果表明无菌保证水平达到10- 3, 并不表示药政部门允许上市产品每1000 瓶中可以有1 瓶是污染品。相反, 这只不过是通过验证数据计算出的可接受的污染概率的理论值。

验证试验结果不合格是无菌工艺验证中的最大难题。这需要进行大量的偏差调查并采取有效的纠偏措施。根据实际经验, 在此列出了一套出现偏差后的调查方法及纠偏措施。

(1) 检查所有与培养基灌装用物品相关灭菌设备的验证资料和灭菌记录;

(2) 检查培养基灌装时的环境监控资料, 包括空气悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面微生物以及操作人员的卫生监测资料;

(3) 将培养基中污染菌和环境监测时所监测到的微生物逐一鉴定到种, 并比较各个污染菌彼此间的相关性;

(4) 检查相关产品无菌试验结果呈阳性的历史资料, 看其污染菌与培养基验证试验中的污染菌是否一致;

(5) 检查以往的培养基灌装资料, 看其中的污染菌是否重复出现;

(6) 检查培养基灌封用容器及胶塞的完好性;

(7) 检查培养基灌装时无菌洁净区的压差记录,是否符合常规;

(8) 检查培养基灌装时的维修和清洁记录;

(9) 检查培养基灌装时的批生产记录和设备运行记录等。

务必要仔细回顾和分析所有的培养基灌装资料及其相关资料, 以准确找出本次偏差的真正原因。尽管环境监测时能监测到微生物, 但多数情况下, 也很难发现其与实际偏差有直接的相关性。一旦出现偏差并完成其调查后, 须立即实施纠偏计划。以下列出了一些在实施纠偏计划时的基本操作程序。

(1) 增加培养基的灌装数量和环境监测数据以查明污染源;

(2) 加强无菌生产环境的清洁和消毒措施;

(3) 增加灌装前静态下的环境监测数据以检查无菌环境条件的可靠性;

(4) 用培养基中的污染菌对消毒剂进行挑战性试验, 以检查污染菌是否对消毒剂有耐受性;

(5) 分别于灌装前、灌装时及灌装后, 增加对操作人员的卫生监控(手套表面微生物和操作服表面微生物) ;

(6) 增加培养基的灌装批次, 以检查所出现的偏差是否具有偶然性。

我国已经建立无菌生产工艺的无菌保证标准和验证标准, 随着与国际接轨的需要, 我们须了解和掌握国外的先进技术、标准和经验, 才能加快提高我国药品在国际市场上的竞争力, 增加药品出口。本文重点介绍的培养基灌装试验只是无菌生产工艺验证中的一种方法, 反映了该领域在当今国际上的先进水平和要求。但是, 由于无菌工艺本身的多样性和复杂性, 很难对其中的每个细节面面俱到, 文中仅对培养基灌装试验中常见的共性问题进行了阐述。

参考资料：1、2010版《药品生产质量管理规范》附录1《无菌药品》

2、 无菌生产工艺验证——培养基灌装试验