后来米兰公爵卢多维科斯福尔札想在教堂安置自己和妻子之墓，准备扩建修道院。达芬奇被这个计划所吸引，同期抵达米兰还有另一位文艺复兴大师和建筑家布拉曼特，他们联手使米兰这座充满中世纪传统气氛的城市成为
文艺复兴时期地一个典范。
他们把教堂后部的半圆顶穹窿拆除，改建为一个高大的圣坛。另建有餐厅、圣器室和方形回廊。而达芬奇则在1495-1497年间在大厅北墙绘制了油画《最后的晚餐》。达芬奇至少用了20年的时间起草，真正开始绘画到完成，则只用了3年时间。它成为整个建筑群体中的极品，画面长8.85米，高4.97米，上方有3个半圆天窗，中间一个最大天窗由庐多维科的王徽装饰，因为这幅画是他委托达芬奇画的。
《最后的晚餐》这一题材在情节的安排和人物内心活动表现上都难以把握。达芬奇主要在当时的绘画透视技法中融入处于萌芽的
巴罗克艺术一些因素，建立一种由上而下展开的稳定型构图。他明显地把主题人物表现出来---门徒聚在一起，光看手姿的多样化：巴多罗迈双手按桌，小雅各和安得列的手呈现怀疑，彼得转身时手握餐刀，犹大紧攥的手中握住赏钱，约翰清白的手，耶稣摊开的手，多马竖指发问，大雅各张开双臂，像在进行辩解，非利扪心自问表白的手势，马太、西门和达太相互问询，显得无辜的手伸向基督，他们虽然姿势各异，但是面向中央基督的神情具有均衡的动感，背景和远景描绘色调比较暗淡，只有基督与门徒群像明显浮现在画面上。
《最后的晚餐》另一个绝妙的地方，在于基督背后的窗，在墙壁上创造了一个通向消失点的平衡框架，这个消失是在基督身后窗子上方的山花，但晕涂法缓和这种严格的平衡，而人物形象自然活动感又进一步缓解。同时由于在高处描绘打开的窗户，所以室内的气氛自然偏重于上方，让仰望观赏的人不致有沉重的压迫感。而且窗口透射进来的光线，正好强调出坐在窗户前面的基督的脸孔具有相当于后光的作用，这都是达芬奇针对餐厅空间所作的处理的技巧，这正是体现了人类创造力的杰作之一。《最后的晚餐》花费了达芬奇四年的心血，他开创了西方文艺复兴的崭新境界，并成为与米开朗基罗的《末日审判》、拉斐尔《雅典学院》并称的文艺复兴全盛时期的三大杰作之一。
不过在1652年，僧侣为了扩大门洞，把画中央人物的脚部都挖去了一块。1796年，拿破仑一世军队侵占米兰，把食堂做了马厩，士兵把壁画中的人物头部作为抛掷石块比赛的目标。由于达芬奇选择材料不当，画面没有打底就直接将颜料涂在干燥的壁面上，所以在壁画完成之前已经开始出现裂痕。之后再经过
第二次世界大战摧残和现代空气的污染，画面已经损坏剥落，加上二次大战以后因修复工作不力所留下的痕迹，壁画《最后的晚餐》已经惨不忍睹。
而这幅杰作仍保存20多幅临摹本。其中最佳的一本奥乔纳临于1510年，与原作少有差异，现存于巴黎
罗浮宫，
联合国教科文组织为保护这幅名画，于20世纪90年代组织的抢救工作已经完成。