2001年,吴佳尼主演个人首部电视剧《
都市山歌》,饰演侗乡姑娘宝妮,该剧是中国首部以音乐舞蹈为表现形式的电视轻喜剧。2002年6月,出演的古装剧《
浪迹天涯》播出,剧中饰演性格豪爽的温柔;8月,由
黄海冰、
宁静、
张静初主演的历史武侠剧《
英雄》开播,她在剧中饰演靖南王郡主朱芷菁;12月,参演
张智霖、
朱茵主演的古装武侠剧《
如来神掌》,饰演柳中原独女柳明鸾,剧中形象活泼可人;同年,她还在首部以太极拳历史为题材的古装剧《
太极英雄》中饰演谈侃侃。
2003年3月,吴佳尼在蒋家骏导演的都市情感剧《
男才女貌》中饰演陶小芳,该剧播出后,在央视同时段电视剧节目中收视率名列第一。9月,出演都市情感剧《
出水芙蓉》,剧中她饰演聪颖美丽的上海体院花样游泳队冠军叶佳,性格独具特色,自负且倔强。同年,还在翻拍的喜剧电视剧《
第101次求婚》中饰演一璇。
2005年,吴佳尼在
张家辉、
蔡琳主演的古装爱情轻喜剧《
新醉打金枝》中饰演升平公主的贴身侍女剑眉,该剧讲述了唐代中叶朝中的两大势力斗争的故事。2006年3月,她与
胡歌、
何润东等人合作出演古装剧《
少年杨家将》,饰演辽朝萧太后之女耶律琼娥,晋封“
银镜公主”,最终嫁给失忆的四郎杨延辉。
2006年,吴佳尼在
范冰冰、
马景涛主演的古装神话电视剧《
封神榜之凤鸣岐山》中饰演妲己的姐妹“琵琶精”胡喜媚,其在拍摄过程中与扮演纣王的台湾演员
马景涛相识,之后二人相恋并于6月26日在上海订婚。2007年1月17日,她与
张智尧、
张智霖共同出演的央视电影频道出品的数字电影《
陆小凤传奇之大金鹏王》上映,本片根据古龙的武侠小说《陆小凤传奇》改编而成,其在剧中饰演上官飞燕。之后便淡出荧幕,专注家庭生活。
2015年吴佳尼全面复出。3月18日,她在由
安以轩、
朱一龙主演的都市情感轻喜剧《御姐归来》中饰演痴情千金女胡娜,让她体验了一次不一样的人生;11月,在播出的职场情感剧《
北上广不相信眼泪》中饰演“微信女孩”妙妙,戏份不多却给观众留下深刻印象,更被称作是该剧中的“颜值担当”。同时她还受邀加盟浙江卫视《
我不是明星》的录制,成为该节目的新晋选手,首次登台的她在节目中表演了多种民族舞蹈。12月15日,吴佳尼与王博、王姬等共同主演的爱情电影《
情定河州》杀青,其在剧中饰演阿伊莎一角。
2017年4月23日,吴佳尼与
安以轩、
朱一龙共同主演的都市时尚剧《
御姐归来》开播,在央视八套播出后取得了收视率破1的好成绩;5月16日,她主演的抗战片《
烈火刀影》开播,其在剧中饰演军统女特工伊敏,其本人表示这是首次接触枪战戏,最初开枪都闭着眼,后来经过训练才克服;7月3日,吴佳尼参演探险夺宝剧《
西夏死书》,饰演叶莲娜一角,在剧中还挑战了极限运动“格斗”。
2019年9月9日,吴佳尼参演的电视剧《
我在未来等你》在爱奇艺独播,该剧讲述了大学老师郝回归穿越到过去,成为自己高中班主任的故事,其在剧中有过留学经验的英语老师Miss Yang。;10月,她参与演出的电视剧《
光荣时代》作为庆祝新中国70周年的献礼作品正式播出,剧中她饰演一个以老鸨身份作掩护的女特务金围脖。该剧首播之日在多家卫视获得不俗收视,并受到多家央媒好评。。
2020年6月18日,吴佳尼出演的武侠古装剧《
暮白首》开播,她在剧中饰演紫烟。开播首日,该剧因高能不断的武侠气息而广受好评。11月17日,她主演的国家广电总局脱贫攻坚重点剧目、时代报告剧《
石头开花》播出,她在剧中饰演黄蛟梅。
2021年5月20日,吴佳尼出演的爱情古装剧《
雁归西窗月》开播,其饰演皇后;11月9日,参演的民国电视剧《
一见倾心》开播,她在剧中饰演谭母;12月17日,其参演的中国首部新时代航天事业电视剧《
问天》在央视一套黄金档开播,她在剧中饰演护肤女军医陈羽琪。该剧自开播便收视破1,口碑和热议持续升温,得到央视新闻力荐,并喜提多个热搜。2022年2月23日,吴佳尼参演的电视剧《
我们的婚姻》开播,其在剧中饰演贺韵美。2023年6月14日,她参演的电影《
寻她》在上海国际电影节首映,其片中饰演的张秀丽,代表着一代女性的觉醒。
2006年2月,吴佳尼与台湾男演员
马景涛在拍摄电视剧《
封神榜之凤鸣岐山》时一见钟情后相恋,6月26日在上海订婚。2007年2月14日,吴佳尼与马景涛在上海注册结婚,因她当时已有身孕,并未举办婚礼;6月,其顺利产下一子,取名为
马世天。2009年1月31日,她生下第二个儿子
马世心。2015年11月30日,吴佳尼与马景涛在节目《
我不是明星》中补办婚礼,甜蜜接吻,相拥而泣。两个帅气的儿子也当起了小花童,一家人幸福美满。
2017年3月30日,吴佳尼与马景涛离婚;4月5日,吴佳尼首次在微博回应离婚一事;6月6日,她与前夫马景涛共同为儿子庆生。2024年,吴佳尼再次与前夫马景涛为儿子庆祝生日。