合成寡核苷酸是通过适当保护的亚磷酰胺核苷的3′端磷酸基团与5′末端羟基的酯化每次产生一个碱基而合成的，5′端羟基是通过一个接头连接到固相载体上。合成是从3′到5′的方向合成，而酶促反应是以相反的方向进行的。每一轮偶联反应包括四种反应：轻度碱水解、轻度酸水解、亲核取代和氧化还原替换。在偶联过程每一阶段反应后，未参与反应的化学物被洗掉。