在一般的荧光现象中，由于激发光的光子密度低，一个荧光分子只能同时吸收一个光子，再通过辐射跃迁发射一个荧光光子，这就是单光子荧光。对于以激光为光源的荧光激发过程，则可能产生双光子甚至多光子荧光现象，这时所用的激发光源强度高，光子密度满足荧光分子同时吸收两个光子的要求。以一般的激光为激发光源的过程中，光子密度仍然不足以产生双光子吸收现象，通常采用飞秒脉冲激光器，其瞬时功率可以达到兆瓦量级。因此，双光子荧光的波长比激发光的波长短，相当于半激发波长激发产生的效果。

优点

与共焦荧光显微镜相比，双光子荧光显微镜具有以下优点：

1.长波长的光比短波长的光受散射影响较小，容易穿透标本；

2.焦平面外的荧光分子不被激发，使较多的激发光可以到达焦平面，并且激发光可以穿透更深的标本；

3.长波处的近红外光比短波长的光对细胞毒性小；

4.使用双光子荧光显微镜观察标本的时候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。