将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中，校正pH。加入琼脂，加热煮沸，以溶化琼脂。加入0.2%酚红水溶液12.5mL，摇匀。分装试管，装量宜多些，以便得到比较高的底层。121℃高压灭菌15min。放置高层斜面备用。
由于KIA培养基含乳糖、葡萄糖、
硫酸亚铁铵和
酚红指示剂。酚红在pH7.4时为红色，细菌分解糖产酸时则变为黄色。因此，底层穿刺接种可以观察细菌动力，对葡萄糖发酵的能力及是否产生硫化氢；斜面可观察细菌对乳糖的发酵情况。肠道致病菌多不发酵乳糖，因此可以区别肠道内的致病菌和
大肠埃希菌。