X射线晶体衍射法（X-ray diffraction）是一种测量蛋白质分子中原子和基团三维排列的方法，利用此法测定蛋白质的结构，结果比较可靠。X射线是波长范围0.01~10nm的电磁波，用于结构分析的单色X射线的波长仅为0.1~1nm，相当于分子中原子之间的距离，故足以分辨并确定蛋白质分子内每个原子的位置。

事实上，X射线晶体衍射法不能直接测定单个分子结构，只能测定品体中原子重复出现的周期性结构。该分析系统主要由三部分组成：X射线源、蛋白质品体和检测器。一细束X射线打到蛋白质晶体上，有一部分直接穿过晶体，其余的向不同方向衍射。X线片可以接受衍射光束，感光乳剂的发黑程度与衍射光束的密度成比例。经计算机可绘制三维电子密度图。