因为Oligo(dT)与mRNA的Poly(A)尾巴可以发生
特异性结合,所以用Oligo(dT)特异结合到mRNA上Poly(A)尾端,以此可以特异地将mRNA从总
RNA中分离出来。属于亲和层析技术。
因绝大多数
真核细胞mRNA 3’端具有Poly(A)尾,Oligo(dT)与其配对,仅mRNA可被
反转录。由于Poly(A) RNA仅占总RNA的1-4%,故此种
引物合成的
cDNA比随机六聚体作为引物所得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。但是在反转录从mRNA获得cDNA时,也可以用随机六聚体引物和
特异性引物。
随机六聚体
引物:当特定mRNA由于含有使
反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时,可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时,体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板,
PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于
rRNA。
特异性引物:最特异的引发方法是用含目标RNA的
互补序列的
寡核苷酸作为引物,若PCR反应用二种特异性引物,第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA,导致更为特异的
PCR扩增。